小檗碱对人鼻咽癌CNE 2细胞内钙含量的影响
【关键词】 右江民族医学院附属医院肿瘤科,广西百色 533000
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研究表明,小檗碱对鼻咽癌细胞有明显的抑制作用[1]。细胞内线粒体参与了肿瘤细胞增殖、凋亡的过程,线粒体的功能与线粒体膜的通透性即跨膜电位差密切相关。有实验证实[2],细胞内大量钙离子储存于线粒体内,钙离子在诱导细胞凋亡中起重大作用。本研究小檗碱作用于体外培养的人鼻咽癌cne2细胞,观察cne2细胞内钙离子浓度水平变化,探讨小檗碱对鼻咽癌cne2瘤株抑制的分子机理。
材料和方法
1.药品
小檗碱由本院自行采集, rpmi1640 培养基为 gibcobrl产品;其余试剂均为国产分析纯。钙离子荧光指示剂:fluo3/am为sigma公司产品,用二甲基亚砜(dmso)配成1.0 mm浓度。
2.细胞株
人鼻咽癌cne2 细胞株购自中科院上海生命科学院细胞库,本院传代保存。
3.方法
(1)细胞培养:cne2细胞株常规培养于含10%胎牛血清的 rpmi1640 完全培养液(青霉素 100 u/ml,链霉素 100 u/ml,谷氨酸 30 μg/ml)置37℃, 5%co2、饱和湿度中培养,所有实验均在细胞处于对数生长期进行。
(2)生长抑制实验[1]:取对数生长期细胞,用完全培养液调整细胞数为 1×106个/ml,接种于 96 孔板, 24 h后分别加入终浓度为:20 mg/l,40 mg/l的小檗碱,同时设置空白对照组(加实验组等体积培养液做对照),每组6复孔。药物作用48 h后,进行流式细胞仪检测。
(3)细胞内钙离子含量测定:①ieca测定方法[3]:用不含ca、mg的磷酸盐缓冲液(pbs)2 ml漂洗细胞2次(1000转/分,5分钟),弃上清后,用pbs稀释,调节cne2细胞数为6×105/ml配成细胞悬液。取两支5 ml试管,第1支加细胞悬液490 μl和10 μl 1.0 mm的fluo3/am液;第2支仅取500 μl细胞悬液,不加fluo3/am液,两支试管均在37℃条件下孵育30分钟,用无ca2+pbs缓冲液洗涤细胞2次,最后加500 μl无ca2+pbs缓冲液待检。②cne2细胞内钙离子(ieca2+)的流式细胞定量检测:应用facscalibur型流式细胞仪(美国bd公司生产)。每份标本(包括fluo3/am染色管和无fluo3/am染色管)均收检2万个cne2细胞。激光源为488 nm氩离子激光,取数之点图x轴取前向散射(fsc)y轴取侧向散射(ssc);以组方图检测荧光强度:荧光素fluo3强度为x轴、y轴为细胞数。③荧光散射强度fl3h以对数(log值)放大,计算机存储检数据。检测条件(包括染色时间、浓度、温度及电压等)保持稳定。以cellquestplot软件(bd公司生产)分析每例样品fluo3/am染色管或无fluo3/am染色管cne2细胞荧光强度(平均道数值),得出每例ieca含量(以细胞内钙离子指数表示ieca2+):
ieca2+=受fluo3/am作用后cne2细胞荧光强度平均道数无fluo3/am作用cne2细胞荧光强度平均道数×1000
结 果
20 mg/l、40 mg/l小檗碱对人鼻咽癌细胞cne2作用后细胞内钙离子浓度变化,经小檗碱处理cne2细胞内钙离子含量增多,与空白组比较有非常显著性差异(p<0.01)。见表1。表1 小檗碱对人鼻咽癌cne2细胞作用后细胞内钙离子浓度变化(略)注:与空白组比较,※p<0.01
讨 论
小檗碱对很多肿瘤细胞生长、繁殖有抑制作用,对鼻咽癌细胞有明显的抑制作用[1],但作用的分子机制尚不清楚。离子钙是细胞内外ca2+唯一的生理活性形式,作为细胞内反应的第二信使,在细胞的生理调控中起着重要的作用。线粒体参与了肿瘤细胞增殖、凋亡的过程。在肿瘤细胞凋亡早期,线粒体首先出现形态改变,同时它参与细胞呼吸、氧的代谢、酶活性和能量供应。这些功能与线粒体膜的通透性即跨膜电位差密切相关。线粒体以一种独特的方式调控着与细胞凋亡有关的因子如钙离子等。线粒体释放这些因子可抑制或促进细胞凋亡,因此,被认为是凋亡调节中心[4]。细胞内大量钙离子储存于线粒体内,钙离子在诱导细胞凋亡中起着主要作用[2]。
本研究显示,小檗碱可上调鼻咽癌细胞cne2内ieca2+含量,提示小檗碱通过改变细胞内钙离子的变化影响线粒体的功能,参与肿瘤细胞增殖、凋亡的过程,其他参与小檗碱抗鼻咽癌cne2细胞增殖和促凋亡机制有待深入研究阐明。
【参考文献】
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[2]fernandez mc,bick sis suppression by bcl-2 is correlated with the regulation of nuclear and cytosolic ca2+[j].oncogene,1996,129110:2259-2265.
[3]尹格平,郝天羽,袁玮,等.妊高征患者外周血红细胞内钙含量测定及其临床价值[j].中国优生与遗传杂志,2001,9(2):20-23.
[4]罗菲君,胡智,曹亚,等.茶多酚诱导鼻咽癌cyclin d1表达下调[j].癌症,2001,20(4):358-362.
作者:罗彪,梁谨,黄世庆,黄冰,侯双雁,黄嵩峰作者单位:右江民族医学院附属医院肿瘤科,广西百色 533000
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