液相微萃取或后萃取技术在中药苯丙酸类化合物

摘要】 　　初步阐明了液相微萃取/后萃取(lpme/be)在苯丙酸类化合物中的萃取机理；建立了浓缩倍数与模型化合物分配系数及理化参数之间的关系。利用自制的液相微萃取装置，优化了lpme/be条件：以聚偏氟乙烯纤维（mof503）为溶剂载体，正庚醇为萃取剂，ph 3.0的hcl分析物水溶液为供相，ph 11.7的naoh为接受相，搅拌速度为1800 r/min，萃取时间为60 min。萃取完成后经hplc分析。模型化合物浓缩倍数ef与其正庚醇/水表观油水分配系数logp有良好线性，r2=0.9653。测得该方法的rsd内＜6.3%，rsd间＜6.6%；检出限为咖啡酸0.025 μg/ｌ；阿魏酸0.250 μg/ｌ；对羟基桂皮酸0.004 μg/ｌ；对甲氧基桂皮酸0.100 μg/ｌ；桂皮酸0.050 μg/ｌ。双黄连口服液中咖啡酸平均回收率为100.3%；浓缩当归丸中阿魏酸平均回收率为99.2%；桂枝茯苓丸中桂皮酸平均回收率为99.4%。本法操作简便、快速、环境友好，能有效去除中药样品中复杂机体的干扰。

【关键词】 液相微萃取/后萃取 高效液相色谱 苯丙酸类化合物 萃取机理 分离优化模型

　　1 引言

　　苯丙酸类化合物主要是桂皮酸的衍生物(结构见图1)。由于羟基在苯环上的数目、排列方式和甲基化程度不同，这类化合物的性质差别较大。文献中报道有关该类化合物的前处理多用溶剂萃取[1～3]，加热回流和索氏提取等方法，这些方法费时且有机溶剂用量大。余燕影等[4]研究了离子液体萃取阿魏酸和咖啡酸的性能和条件。本实验用液相微萃取/后萃取(lpme/be)方法[5～8]建立了5种苯丙酸类化合物——咖啡酸、阿魏酸、桂皮酸、对羟基桂皮酸和对甲氧基桂皮酸（结构式见图1）的前处理方法，并初步阐明了该类化合物的“电荷转移超分子”萃取机理，建立了浓缩倍数与理化参数间的关系，为该类化合物的提取、分离、纯化和浓缩提供了理论依据；与高效液相色谱法相结合，测定了双黄连口服液中咖啡酸，浓缩当归丸中阿魏酸和桂枝茯苓丸中桂皮酸的含量，准确度与精密度都达到了分析方法的要求。lpme/behplc法可以为该类化合物的质量控制提供一种有效、经济、绿色且快速的前处理方法。

　　图1 苯丙酸类化合物化学结构式（略）

　　fig.1 chemical structure of phenylpropionicacids

　　桂皮酸（methoxy cinnamic acid）： r1=r2=h； 咖啡酸（caffeic acid）： r1=r2=oh； 阿魏酸（ferulic acid）： r1=oh, r2=och3； 对羟基桂皮酸（phydroxycinnamic acid）：　r1=oh, r2=h；　对甲氧基桂皮酸（cinnamic acid）：　r1=och3, r2=h。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　lcvp高效液相色谱仪（日本岛津公司），聚丙烯纤维（天津大学化工学院膜研究所），聚偏氟乙烯中空纤维（mif503，内径为0.8 mm，孔径为0.1μm），聚偏氟乙烯中空纤维（mof503）及其它纤维（天津膜天膜工程技术有限公司，内径为0.8 mm，孔径为0.2 μm）。咖啡酸对照品、阿魏酸对照品和桂皮酸对照品均为中国药品生物制品检定所提供;对羟基桂皮酸对照品和对甲氧基桂皮酸对照品为武汉远城科技发展有限公司提供，双黄连口服液（哈药集团三精制药股份有限公司）; 浓缩当归丸（河南宛西制药股份有限公司），桂枝茯苓丸（山西天生制药有限责任公司）。正构醇（分析纯，天津市光复精细化工研究所）。实验用水为二次蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 色谱条件 c18柱（250 mm×4.6 mm i.d.， 5 μm， dikma technologies, kromasil 100），检测波长为285 nm，流速为1.0 ml/min，柱温28 ℃，进样量为20 μｌ，流动相为ｖ（甲醇）∶ｖ（0.3% ｈ３ｐｏ４）＝53∶47。

　　2.2.2 溶液配制 精密称取5种化合物各10.0 mg，用甲醇溶解并稀释，制成浓度为1.0 g/ｌ的对照品储备溶液，4 ℃冰箱保存，备用。

　　2.2.3 实验步骤 将放有微型搅拌磁子的细长小玻璃管固定于磁力搅拌器上，加入2 mｌ样品溶液。将10 cm长的中空纤维管洗净吹干后在正庚醇中浸泡10 s，使其孔壁充满正庚醇，然后用注射器推出纤维管内多余的正庚醇，将此中空纤维管弯曲成u形并注入ph 11.7的naoh溶液，浸入到样品溶液中，开启磁力搅拌器，在1800 r/min搅拌速度下萃取60 min，萃取结束后收集接受相，进行hplc分析。

　　3 结果与讨论

　　3.1 液相微萃取/后萃取条件的选择

　　3.1.1 中空纤维的选择 考察了聚砜、聚偏氟乙烯（mif503）、聚偏氟乙烯（mof503）、聚丙烯和聚醚砜5种中空纤维作为有机溶剂载体的萃取效果，结果表明聚偏氟乙烯（mof503）纤维对于5种苯丙酸类化合物的萃取效果均最好，故选用聚偏氟乙烯（mof503）纤维作为有机溶剂的载体。

　　3.1.2 萃取剂的选择 考察了正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正癸醇的萃取效率。结果表明：正庚醇的萃取效率最高，正丙醇、正丁醇和正戊醇基本不萃取。这可能是由于正庚醇与苯丙酸类化合物的极性、强度和疏水性有最佳的匹配，能有效溶解被分析物，萃取效率较高。故选择正庚醇作为萃取剂。

　　3.1.3 供相及接受相ph的选择 被分析物中含有苯丙稀酸结构单元，供相中加入适当的酸使其以分子状态存在，接受相中加入适当的碱使其以离子状态存在，利于其从供相经有机相向接受相传递。本实验考察了ph为2.0、2.3、3.0、3.3、4.0的hcl供相体系和ph为11.0、11.7、11.8、12.0、12.7的naoh接受相体系对萃取效率的影响。结果表明：当供相ph为3，接受相ph为11.8时，5种被分析物的萃取效率均较高；当ph小于3时，分析物被质子化，不利于正庚醇萃取。当接受相11.5＜ph＜12时，被分析物大量离子化；而ph继续增大，过量的oh－与膜孔隙中的正庚醇的oh－形成氢键，阻碍了正庚醇和分析物的结合，再者，中空纤维对碱的耐受值为ph 12，碱性太强，中空纤维的性状可能发生变化，影响正庚醇在中空纤维孔隙中的稳定性。故选择ph 3.0的hcl作为供相，ph 11.8的naoh溶液作为接受相。

　　3.1.4 供相中无机盐浓度的选择 考察在供相中加入2.5%、10%、20%和30% ４种不同浓度nacl溶液对萃取率的影响[9，１０]，结果表明，随着盐浓度的增加，萃取率降低明显。故供相中不加入无机盐。

　　3.1.5 搅拌速度的选择 考察转速分别为300、600、900、1200、1500和1800 r/min时的萃取率，发现转速越大萃取效率越好。故选择1800 r/min为搅拌速度。

　　3.1.6 萃取时间对萃取效率的影响 考察萃取时间分别为20、40、60、90和120 min时的萃取率，发现萃取60 min时萃取基本达平衡。萃取时间继续延长，萃取率基本不变。故选择萃取时间为60 min。

　　3.2 方法学实验

　　3.2.1 工作曲线绘制 精确吸取一定体积储备液于20 mｌ容量瓶中，混匀后用水稀释至刻度，得对照品混合溶液：含咖啡酸2.5 mg/ｌ，阿魏酸5.0 mg/ｌ，对羟基桂皮酸1.0 mg/ｌ，对甲氧基桂皮酸和桂皮酸均为2.0 mg/ｌ。然后将该溶液稀释不同倍数制成系列标准溶液，按实验步骤萃取后，经hplc检测，利用色谱峰面积y对分析物浓度c进行线性回归，结果见表1。按３倍信噪比计算得到检出限，结果见表1。

　　3.2.2 精密度实验 精确吸取一定体积储备液，稀释不同倍数配制成1.00、0.10和0.01 mg/ｌ高、中、低３种浓度的标准溶液，按实验步骤萃取后，经hplc检测，每个浓度平行操作５次得日内精密度rsd内＜6.3%；连续测定３日得日间精密度rsd间＜6.6%。

　　3.2.3 回收率实验 精确吸取150 μｌ双黄连口服液至100 mｌ容量瓶中，加入30 μｌ咖啡酸储备液，用ph 3稀hcl制成含67.5 μg咖啡酸的样品溶液，按实验步骤萃取后测得咖啡酸的回收率，结果见表2。

　　表1 分析物的工作曲线数据（略）

　　table 1 ｄata of calibration curve of analytes

　　精确称取1.0534 g浓缩当归丸药粉于锥形瓶中，加入0.20 mｌ阿魏酸储备液，30 mｌ 70%甲醇浸渍20 min，称重，超声提取30 min，称重并用70%甲醇补足损失的重量。取上清液1.00 ml，用ph 3的hcl溶液稀释至50.00 ml，制得萃取工作液。萃取后测得阿魏酸的回收率。同法，精密称取5.0037 g桂枝茯苓丸碎粒，加入60 μl桂皮酸储备液，加入30 ml 50%甲醇超声提取30 min。取上清液1.00 ml，用ph 3的hcl溶液稀释至10.00 ml，制得萃取工作液，萃取后测得桂皮酸的回收率，结果见表2。

　　表2 目标化合物加样回收率实验（n=5）（略）

　　table 2 ｒecovery of standard addition in analytes(n=5)

　　3.2.4 中药制剂中化合物的含量测定 精确吸取150 μｌ双黄连口服液，精确称取1.0570 g浓缩当归丸药粉和4.9907 g桂芝茯苓丸碎粒，按照回收率实验项操作分别制得３种制剂的萃取工作液。按实验步骤平行萃取3次，经hplc分析（色谱图见图2），测得咖啡酸在双黄连口服液中的平均含量为0.25３ g/ｌ，阿魏酸在浓缩当归丸中的平均含量为0.21４ mg/g，桂皮酸在桂芝茯苓丸中的平均含量为0.01３ mg/g。

　　图2 制剂中化合物液相色谱图（略）

　　fig.2 chromatograms of analytes in the preparations

　　a． 对照品（control article）； b． 双黄连口服液(shuanghuanglian peroral fluid); c. 浓缩当归丸(danggui concentrated pellet); d. 桂枝茯苓丸(guizhifuling pellet); 1. 咖啡酸(caffeic acid); 2. 阿魏酸(ferulic acid); 3. 桂皮酸(cinnamic acid); a. 萃取前(before microextraction); b. 萃取后(after microextraction)。

　　3.3 lpme/be机理研究

　　3.3.1 浓缩倍数的计算 根据公式ef=cs1／cs2计算浓缩倍数。ef为浓缩倍数，cs1和cs2分别为一定浓度的化合物经过正庚醇萃取和无溶剂（纤维未经有机溶剂浸泡）萃取60　min得到的接受相中的浓度。结果及相关理化参数见表3。

　　表3 化合物浓缩倍数与理化参数（略）

　　table 3 data of concentration multiple and physicochemical parameters of analytes

　　* 注（note）：正庚醇/水表观油水分配系数按经典摇瓶法测得，其它理化参数值从专业网站获得(annotation: partition coefficiens of nheptanolwater were measured by shake flask method and other physicochemical parameters were got from ).

　　3.3.2 浓缩倍数与化合物理化参数相关关系 将浓缩倍数（ef）与各理化参数进行相关分析，5种化合物的ef与logp线性相关性良好，相关系数为0.9653，说明分配系数是决定化合物浓缩倍数的主要因素。部分化合物的ef与理化参数相关结果见表4和表5。

　　表4 咖啡酸、阿魏酸和桂皮酸的浓缩倍数与其理化参数相关关系（略）

　　table 4 correlated relationships of concentration multiple and physicochemical parameters of caffeic acid, ferulaic acid and cinnamic acid

　　ｅｆ： concentration multiple.

　　表5 咖啡酸、对羟基桂皮酸和桂皮酸的浓缩倍数与其理化参数相关关系（略）

　　table 5 ｃorrelated relationships of concentration multiple and physicochemical parameters of caffeic acid, phydroxycinnamic acid and cinnamic acid

　　由表4可知：对于咖啡酸、阿魏酸和桂皮酸来说，ef和logp正相关，与pka和n负相关。由表5可知：咖啡酸、对羟基桂皮酸和桂皮酸的ef与logp正相关，与s负相关。由表4和表5中n与logp之间关系可以看出：该类化合物logp的大小与其结构中的羟基数有关，与羟基周围有无取代基及取代基种类无关，因为不同化合物得到的n与logp回归方程的斜率和截距几乎相等。

　　由此可见，苯丙酸类化合物lpme/be的浓缩倍数不仅决定于萃取条件的选择，还决定于化合物的理化性质与结构，是多种因素共同作用的结果，其中分配系数是决定浓缩倍数的主要因素。

　　3.3.3 以聚偏氟乙烯（mof503）中空纤维为支持体的电荷转移超分子萃取机理 本实验中聚偏氟乙烯（mof503）纤维的萃取效率明显高于其它纤维。该纤维在萃取过程中不仅起到了溶剂支持体和微孔过滤的作用，而且还参与了苯丙酸类化合物的萃取。萃取机理可能是：聚偏氟乙烯的取代基f电负性极强，f富电子；分析物中苯环与双键共轭，电子云密度降低，苯环缺电子。缺电子苯环与富电子f形成电荷转移超分子，使得被分析物在中空纤维膜表面聚集，有利于被萃取剂萃取。而苯丙酸类化合物在碱中立即离子化，电荷转移超分子被破坏， f获得电子，继续和新的分析物形成电荷转移超分子，分析物被后萃取到接受相中，提高了萃取效率和浓缩倍数。

　　图3为萃取前后的聚偏氟乙烯纤维内壁电镜扫描图。由图３a可知：未经有机溶剂浸泡过的纤维有明显的孔隙，孔径较大；经正庚醇浸泡并挥干表面溶剂后的纤维（图３b）其孔隙几乎全部被正庚醇覆盖，说明正庚醇可以在纤维孔隙中稳定存在；图３c为按实验步骤操作，萃取后的纤维内壁电镜扫描图，与图３b比较可看到明显的孔隙，与图３a比较，孔隙少、孔径小。这是由于在萃取过程中部分正庚醇进入了接受相，因此在进行hplc分析时可以检测到正庚醇的吸收峰。在萃取过程中，电荷转移超分子的形成仅助于被分析物在纤维表面聚集，增加萃取效率，并不引起纤维性质的变化，同时，发现纤维经过适当的处理后可以回收再用。

　　图3 聚偏氟乙烯纤维内壁电镜扫描图（×4000）（略）

　　fig.3 electron microscope scanograms of polyvinylidene difluoride hollow fiber′s inner wall (×4000)

　　a． 干燥纤维（the desiccative hollow fiber）；b． 被正庚醇浸泡过的纤维（the hollow fiber which soaked in nenanthol）；c． 萃取化合物之后的纤维（the hollow fiber which extracted analytes）。

【参考文献】
　　1 li yun(李 芸), feng shiｌan(封士兰), zhao liangｇong(赵良功), hu fangｄi(胡芳第). chinese journal pharmaceutical analysis(药物分析杂志), 2006, 26(11): 1588～1561

　　2 gao qiuｔao(高秋涛), bi kaiｓhun(毕开顺). chinese traditional herbal drugs(中草药), 2003, 34(10): 913～914

　　3 ci lei(慈 磊), tang xing(唐 星), he zhongｇui(何仲贵). chinese journal of pharmaceutical analysis(药物分析杂志), 2004, 24(1): 84～86

　　4 yu yanying(余燕影), zhang wei(张 玮), cao shuwen(曹树稳). chinese j. anal. chem.(分析化学), 2007, 35(12): 1726～1730

　　5 khalilizanjania m r, yaminia y g, yazdanfar n, shariati s. anal. chim. acta, 2008, 606: 202～208

　　６ chiang ｊ ｓ, huang ｓ ｄ. talanta, 2007, 71: 882～886

　　７ li jianｗei(李建伟), bai xiaoｈong(白小红), chen xuan(陈 璇), fan youｊian(范有建). chinese pharmaceutical journal(中国医院药学杂志), 2007, 11: 1514～1517

　　8 bai xiaohong(白小红), yang xue(杨 雪), chen xuan(陈 璇), wang linhui(王琳慧). chinese j. .(分析化学), 2008, 36(2): 182～186

　　９ wu ｙ ｌ, xia ｌ ｂ, chen ｒ, hu ｂ. talanta, 2008, 74: 470～477

　　１０ chiang j s, huang s d. talanta, 2007, 71: 882～886