芍药苷对STZ损伤的INS1细胞的保护和修复作用

【关键词】 芍药苷;ins1细胞;stz;抗氧化能力

【摘要】 目的 研究中药单体芍药苷对ins1细胞的影响，及对链脲佐菌素(stz)损伤的胰岛细胞的保护、修复作用，并初步探讨其保护机制。方法 ins1细胞传代培养后，用四氮唑蓝(mtt) 比色法测定细胞增殖活力，并测定细胞培养液中胰岛素浓度、丙二醛( mda) 浓度、总抗氧化能力(taoc )。结果 芍药苷可促进ins1细胞释放胰岛素。stz损伤后，ins1细胞活力降低;胰岛素分泌量减少;mda含量明显升高;taoc下降。芍药苷保护组能不同程度改善stz引起的上述指标的改变。结论 芍药苷可促进ins1细胞释放胰岛素，对stz损伤的ins1细胞有显著的保护作用，这种作用可能是通过提高ins1细胞的抗氧化能力实现的。

【关键词】 芍药苷;ins1细胞;stz;抗氧化能力

　【abstract】 objective to study the effect of the traditional chinese medicine monomer paeoniflorin on ins1 and the protective and prosthetic effects of paeoniflorin on stzinduced ins1 cell damage, and to explore its protective mechanisms. methods after subculturing ins1 cells, the cell viability were determined by tetrazolium (mtt) assay; and insulin concentrations, malondialdehyde (mda) concentration and total antioxidant capacity (taoc) of cell culture medium were also tested. results paeoniflorin promoted the release of insulin; after stz injury, the cell viability and insulin of ins1 were declined; mda concentration was increased significantly;and taoc capacity was paeoniflorin protection group improved these indicators that induced by stz on various extent. conclusions paeoniflorin can promote the insulin release of ins1 cells, and has a significant protective effect on stzinduced ins1 cells damage, that may be achieved through increasing antioxidant capacity of ins1 cells.

　　【key words】 paeoniflorin;ins1 cell; stz;antioxidant capacity

　　肥胖与胰岛素抵抗(ir)高度相关，ir是肥胖者发生2型糖尿病、高血压及脂质代谢紊乱等的重要原因。芍药苷(paeoniflorin)是芍药的主要有效成分之一，具有止痛、镇静、解痉、抗炎以及抗自由基损伤的作用〔1～3〕。前期实验发现白芍水提取液可以抑制去卵巢大鼠肥胖，改善脂代谢紊乱，清除体内过多自由基〔4〕;离体实验证明芍药苷促进离体脂肪组织释放游离脂肪酸及降低丙二醛(mda)的含量，提高总抗氧化能力(taoc)水平。而芍药苷对胰岛细胞有否作用，目前国内外尚未见报道。因此本实验观察了芍药苷对胰岛细胞的影响及对stz损伤后胰岛细胞的保护、修复作用，并初步探讨其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　大鼠胰岛素瘤细胞(ins1)购自中国典型培养物保藏中心(cctcc)，中药单体芍药苷购自陕西旭煌植物科技公司，1640培养基购自gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，噻唑蓝(mtt)购自sigma公司，胰岛素放射免疫试剂盒购自中国原子能研究所，taoc、mda试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　ins1用含10%小牛血清的1640培养液，37℃，5%co2饱和湿度细胞培养箱内培养，0.25%胰蛋白酶1 ml消化2～4 min后传代，分瓶继续培养，2～3 d传代一次。

　　1.2.2 胰岛素、mda、taoc测定

　　ins1按1×105个/ml、每孔200 μl置于96孔培养板，培养24 h后，分别加入不同浓度的葡萄糖(5.6、8.4、11.2、16.8、22.4、33.6 mmol/l)、链脲佐菌素(stz)及芍药苷，药物容量均为10 μl。药物作用一定时间后，收集细胞培养液，用放射免疫法测胰岛素含量，比色法测定mda含量和taoc。

　　1.2.3 mtt法测定胰岛细胞增殖活力

　　ins1 1×105个/ml、每孔100 μl置于96孔培养板，培养24 h后，分别加入各浓度药物作用12 h后，每孔加入5 mg/ml的mtt 10 μl，放入孵箱中培养4 h后，每孔加入二甲基亚砜100 μl，过夜，用全自动酶标仪测定570 nm处吸光度(a)值，进行组间比较。

　　1.3 分组

　　共分为五组：①正常对照组：培养的ins1细胞不做任何干预处理;②芍药苷组：培养液中分别加入终浓度为1×10-5mol/l、1×10-6mol/l、1×10-7mol/l的芍药苷，作用12 h;③stz损伤组：培养液中加入stz，使终浓度为3 mol/l，作用12 h;④芍药苷保护组：培养液中加入终浓度1×10-7mol/l的芍药苷和stz(终浓度为3 mmol/l)，作用12 h;⑤芍药苷修复组：培养液中先加入stz(终浓度为3 mmol/l)作用6 h后，加入终浓度为1×10-7mmol/l的芍药苷，继续作用6 h。

　　1.4 统计学分析

　　采用spss10.0软件，计量资料用x±s表示，组间显著性差异采用单因素方差分析法。

　　2 结 果

　　2.1 ins1对葡萄糖的刺激反应

　　与正常对照组相比，随着葡萄糖浓度的增加(5.6～16.8 mmol/l)，ins1分泌的胰岛素量也逐渐增加;但22.4 mmol/l、33.6 mmol/l的葡萄糖则使胰岛素的分泌量随葡萄糖浓度的增加有所减少。见图1。与正常对照组比较：1)p<0.05，2)p<0.01　　图1 ins1对葡萄糖刺激的反应(x±s，n=6)

　　2.2 芍药苷对ins1的作用

　　与正常对照组相比，芍药苷各浓度组对ins1增殖活力无明显影响(p>0.05);芍药苷1×10-6 mol/l组和1×10-7mol/l组可以显著促进ins1胰岛素释放(p<0.05;p<0.01)，而1×10-5mol/l的芍药苷对胰岛素分泌无统计学差异(p>0.05)。见表1。表1 芍药苷对ins1的作用表2 芍药苷对stz损伤的ins1的作用

　　2.3 芍药苷对stz损伤的ins1的保护作用

　　如表2所示，与正常对照组相比，stz损伤组的ins1增殖活力显著降低(p<0.01)，胰岛素分泌量显著减少(p<0.01)，mda含量升高(p<0.01)，taoc能力下降(p<0.05)。与stz损伤组相比，芍药苷保护组的胰岛素分泌量明显升高(p<0.05)，mda含量明显降低(p<0.05);但芍药苷修复组的各个指标与stz组相比没有明显变化(p>0.05)。

　　3 讨 论

　　肥胖是大多数疾病的重要危险因素，肥胖患者往往伴随体内脂肪堆积及糖、脂肪代谢的异常。本实验采用大鼠腺肿瘤β细胞ins1，ins1是在sv40冰冻转染的胰腺胰岛细胞基础上建立的，有较好的稳定性，可以在糖、胰高血糖素刺激下分泌胰岛素，并被糖皮质激素所抑制，故ins1成为体外研究胰岛细胞功能的理想模型。本实验证实ins1胰岛素分泌量在一定范围内，随着葡萄糖浓度的升高(8.4～16.8 mmol/l)逐渐增加，说明葡萄糖可以刺激ins1分泌胰岛素，而且呈一定的剂量效应关系;但当葡萄糖浓度过高时(22.4 mmol/l，33.6 mmol/l)胰岛素分泌量又逐渐下降，这与文献报道一致〔5，6〕。表明该细胞对葡萄糖刺激具有良好的反应性。

　　芍药苷是从芍药中提取的最主要的生物活性成分，现代医学认为具有多种药理活性。芍药苷具有抗自由基损伤、抑制细胞内钙超载等多种生物学效果。前期实验已证明白芍水提取液能显著抑制去卵巢肥胖大鼠的体重和血清甘油三酯水平的升高，改善大鼠体内脂代谢紊乱。芍药苷可以促进离体脂肪组织释放游离脂肪酸，但芍药苷是否对胰岛细胞有直接的影响作用，目前国内外尚未见报道。本实验研究显示，芍药苷可以促进ins1胰岛素的释放。

　　糖尿病的发生与胰岛β细胞的损伤和功能异常有关。氧自由基和一氧化氮(no)可以导致胰岛β细胞损伤。与其他组织细胞相比，胰岛细胞内抗氧化物酶水平较低，因此，在一些因素的诱导下，容易发生氧化应激反应〔7〕。mda是氧自由基作用于生物膜中多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化的主要代谢产物，能促使蛋白质合成能力下降或合成功能紊乱，其水平的高低反映了受氧自由基攻击的程度。细胞taoc主要是细胞外液中非酶促体系的抗氧化物质和酶促体系少数小分子抗氧化物质的总和，是反映组织抗氧化能力的重要指标之一。stz对实验动物的胰岛β细胞具有高度选择性毒性作用。在本实验中发现，加入stz后，胰岛细胞活力、胰岛β细胞分泌功能明显受到抑制，stz损伤组中胰岛素含量较正常对照组明显减少。同时，细胞taoc明显降低，而mda含量显著升高，提示stz可能通过胰岛细胞生物膜脂质过氧化损伤、抑制胰岛细胞抗氧化能力，导致自由基清除障碍，从而使其分泌胰岛素的功能降低。在芍药苷保护组中预先加入芍药苷后，stz所致的胰岛素分泌量明显回升，同时mda水平显著降低，提示芍药苷能有效保护stz引起的胰岛细胞损伤，并使胰岛细胞的功能有所恢复。表明芍药苷对胰岛细胞的作用可能部分是通过增强胰岛细胞清除氧自由基的能力而发挥其保护效应的。而芍药苷修复组中，在stz损伤胰岛细胞后再加入芍药苷，stz所致的细胞活力、胰岛素分泌量降低程度没有明显改善， taoc、mda含量也没有明显改变，提示在胰岛细胞损伤后，芍药苷的修复作用不明显。因此，对肥胖患者及早干预治疗，可有效预防糖尿病，对控制血糖水平、保护胰岛细胞有很重要的临床意义。

【参考文献】
　1 孙丽荣，曹 雄，侯凤青，等.芍药苷研究进展〔j〕.中国中药杂志，2008;33(18):202832.

　　2 zhang xj,chen hl,li z,et sic effect of paeoniflorin in rats with neonatal maternal separationinduced visceral hyperalgesia is mediated through adenosine a(1) receptor by inhibiting the extracellular signalregulated protein kinase (erk) pathway〔j〕.pharmacol biochem behav，2009;94(1)：8897.

　　3 朱爱江，方步武，吴咸中，等.芍药甘草汤的抗炎作用研究〔j〕.天津医药，2009;37(2):1203.

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　　5 董凌燕，刘 超，张 梅，等.不同浓度葡萄糖对大鼠胰岛β细胞胰岛素基因表达的影响〔j〕.中华糖尿病杂志，2004;12(1):612.

　　6 楼大钧，李宏亮，杨文英.胰岛b细胞脂性凋亡研究进展〔j〕.中国实用内科杂志，2006;26(19):15535.

　　7 赵 琳，邹大进.氧化应激致胰岛β细胞损伤的研究进展〔j〕.国际内分泌代谢杂志，2006;26(s1):113.