pcDNA3.1preS1GFP重组质粒构建及其小鼠精子表达

【关键词】 绿色荧光蛋白质类;质粒;肝炎病毒,乙型;精子;转染;小鼠

【摘要】 目的 构建绿色荧光蛋白(gfp)与乙型肝炎病毒(hbv)pres1基因的重组真核表达载体并观察其在小鼠精子内的表达。方法 采用pcr方法,以hbv全基因组质粒为模板扩增hbv pres1基因片段,利用dna重组技术将其定向插入到含有gfp的真核表达载体pcdna3.1gfp,经酶切及测序鉴定后,用脂质体介导法转染小鼠精子,在荧光显微镜下观察并应用pcr技术检测hbv pres1基因的存在与表达情况。结果 成功构建了pcdna3.1pres1gfp真核表达载体,将其转染小鼠精子后，在荧光显微镜下观察到转染精子头部有绿色荧光，pcr扩增得到位于hbv pres1基因区域内长约589 bp的片段。结论 重组质粒pcdna3.1pres1gfp的成功建立及其在小鼠精子内的表达，为建立新的hbv dna垂直传递的小鼠模型奠定了实验基础。

【关键词】 绿色荧光蛋白质类;质粒;肝炎病毒,乙型;精子;转染;小鼠

　construction of pcdna3.1pres1gfp recombinant plasmid and expression of sperm in mice li qian, wang peilin, wang liang, et al (department of biology, qingdao university medical college, qingdao 266021, china); [abstract] objective to construct pcdna3.1pres1gfp recombinant eukaryotic expression vector harboring green fluorescent protein (gfp) and hepatitis b virus (hbv) pres1 gene and observe the expression of sperm in mice. methods the hbv pres1 gene fragment was amplified from the hbv genome plasmid by pcr and inserted into eukaryotic expression vector pcdna3.1gfp. after the identification by digestion and sequencing, the recombinant eukaryotic expression vector was transfected into sperm of mouse by lipofectamine tm2000. expression of gfp was examined directly with fluorescence microscope. the existence and expression of hbv pres1 gene was detected by pcr. results the eukaryotic expression vector was created successfully and transfected to sperm of mouse with pcdna3.1pres1gfp recombinant plasmid, green fluorescence was observed with fluorescence microscope, which presented on the head of sperm, and a specific band at 589 bp tha in the area of hbv pres1 gene was obtained by pcr. conclusion the successful construction of the pcdna3.1pres1gfp recombinant plasmid and its expression in sperm of mouse establishes an experiment foundation for creating a new mouse model of verticaltransmission hbv dna.

　　[key words] green fluorescent proteins; plasmids; hepatitis b virus; sperm; transfection; mice

　　乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hbv)感染引起的一种在全球范围流行的传染病,严重危害人类的健康。是影响人类生存最重要的病毒之一, 全世界至少有3.5亿人感染hbv,在我国，其在人群中的感染率已经达到10%。hbv是一种部分双链的环状病毒, 具有随机整合入宿主基因组中的能力[1]。垂直传播是hbv感染的重要传播途径之一,动物实验业已证实生殖细胞内hbv dna可通过受精过程稳定地传给子代[2]。由于hbv感染具有明显的种属特异性和组织特异性,易感宿主局限于人及黑猩猩等高级灵长类动物,引起以肝组织为主的损害,因而限制了人们对hbv的垂直传播机制的研究。近年来,国内外采用转基因技术,建立了多种hbv单基因或全基因组的转基因小鼠模型,这从一定程度上打破了hbv小鼠模型缺乏的局面[3]。但是,常规分子生物学方法和免疫组织化学的方法检测代价较高、费时费力，因此,目前制备转基因动物的效率并不是很高。本文利用dna重组技术，选取hbv pres1基因与pcdna3.1gfp质粒构建新的真核表达载体pcdna3.1pres1gfp,并转染小鼠精子，利用重组质粒中起示踪作用的绿色荧光蛋白(gfp)做标记，简化乙型肝炎转基因动物的育种,为进一步进行hbv垂直传播的研究打下基础。现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物 出生后12～14周的雄性昆明系性成熟小鼠，购于青岛口岸药品检验所。

　　1.1.2 质粒与菌株 pbr322hbv质粒由汕头大学医学院黄天华教授惠赠，该质粒包含hbv全长dna序列。pcdna3.1gfp质粒由哈尔滨医科大学傅松滨教授惠赠，保存于本实验室。该质粒全长6.1 kb，包含cmv启动子、多克隆位点(mcs)、氨苄抗性基因及egf基因。

　　1.1.3 主要药品试剂 pcr试剂、dl 15 000购自广东东盛生物科技有限公司;限制性内切酶ecorⅰ与xbaⅰ均购自fermentas公司;dna提取试剂盒、胶回收试剂盒、markerⅱ以及质粒小提试剂盒均购自tiangen生化科技有限公司;脂质体lipofectaminetm2000为invitrogen公司产品;dh5α感受态细胞、t4 dna ligase均购自北京全式金生物技术有限公司;所用引物由上海生工生物工程有限公司合成;dna测序由tiangen生化科技有限公司承担;其他化学试剂均为国产分析纯产品，m2培养液自行配制。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pcr技术扩增hbv基因组pres1基因片段 依据genbank中的ayr亚型hbv基因组序列，参考文献[4]方法设计扩增hbv pres1基因的pcr引物，其中引物上、下游分别加有ecorⅰ和xbaⅰ内切酶酶切位点(斜体处为酶切位点)。引物p1：5′cggaattcatgcagtggaactcca3′;p2：5′gctctagattaaatgtatacccaaagac3′。pcr产物长度为850 bp。于15 g/l的琼脂糖凝胶上电泳分离，切胶回收、纯化pres1片段。

　　1.2.2 pcdna3.1pres1gfp真核表达载体的构建 将纯化得到的hbv pres1片段与pcdna3.1gfp质粒分别用限制性内切酶ecorⅰ和xbaⅰ进行双酶切，于10 g/l的琼脂糖凝胶上电泳、回收纯化酶切产物，经t4 dna连接酶16 ℃过夜连接后，转化dh5α感受态细胞,氨苄青霉素筛选培养,挑取阳性克隆扩增后提取质粒进行双酶切和dna测序鉴定。

　　1.2.3 精子采集、获能 取性成熟的雄性小鼠，单独饲养3 d以上。断颈处死后取出双侧附睾，迅速放置于37 ℃预温的m2培养液中[5]，用无菌剪刀在附睾的尾部剪一小口[67]，放入37 ℃、含体积分数0.05co2培养箱中孵育15 min，使精子充分游出。离心5 min，收集沉淀物，置2 ml预温的m2培养液中，37 ℃孵育1.5 h，取上游精子，用血细胞计数板计算精子密度，将密度调整至1×1010/ l。

　　1.2.4 脂质体转染 向已获能的精子按比例滴加终浓度为1.5 mg/l的与脂质体lipofectaminetm2000共孵育后重组质粒pcdna3.1pres1gfp[8]，混匀，放入培养箱内继续孵育60 min。空白对照组不滴加任何转染复合物。

　　1.2.5 精子活力评估 血细胞计数板计数精子转染前后的不活动精子数，计数500个精子，以评估精子的活力。

　　1.2.6 转染精子洗涤与观察 根据文献[89]，将共孵育精子用预温m2培养液洗涤5次,pbs洗涤3次,每次10 min，8 000 r/min离心5 min,尽量吸去上清液，充分去除精子表面附着外源dna。用40 g/l多聚甲醛pbs缓冲液固定20～30 min,pbs洗涤3次, pbs悬浮，涂片于1 g/l的多聚赖氨酸处理的载玻片上，风干，置于荧光显微镜下观察。

　　1.2.7 转染后精子hbv pres1检测 按照dna提取试剂盒说明要求，分别提取转染重组质粒的精子与空白对照组的精子的dna进行pcr扩增。根据hbv pres1序列设计、合成引物，目的片段长589 bp，上游引物：5′cagtatctgctccctgctt3′;下游引物：5′ccaaactgagtgccccta3′。pcr的反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环;最后72 ℃延伸10 min。

　　1.2.8 统计学处理 精子活力的比较采用pearson χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 pcr技术扩增hbv基因组pres1基因片段

　　pcr产物经15 g/l的琼脂糖凝胶电泳40 min后，结果显示pcr所扩增的hbv pres1基因片段长850 bp，与预计相符。表明已获得hbv pres1基因片段(图1)。

　　2.2 重组真核表达载体的鉴定

　　重组质粒pcdna3.1pres1gfp经限制性内切酶ecorⅰ和xbaⅰ双酶切后电泳，切出与对应目的基因大小相符的条带。空载体pcdna3.1gfp经相同双酶切后电泳仅见长约6 100 bp一条带(图2)。这表明已成功构建重组表达载体。重组体中插入片段以及部分载体序列经测序分析,结果显示所测序列与对应已知序列相符。

　　2.3 转染前后精子活力评估

　　倒置显微镜下观察转染前后活动精子个数的变化,用计数板计数法。随机选取精子500个以评估精子活力,转染前活动精子418个,占83.6%;转染后活动精子415个,占83.0%,转染前后精子活力比较差异无统计学意义(χ2=0.065，p>0.05)。

　　2.4 转染后精子的观察

　　荧光显微镜下观察转染后精子的涂片，在视野下可见许多绿色荧光标识的精子出现,而未进行转染的对照组则无绿色荧光。绿色荧光多集中在精子头部区域。证明在转染重组质粒后的精子细胞中有绿色荧光蛋白表达。

　　2.5 转染后精子pres1基因的pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测

　　转染后精子的pcr产物经15 g/l的琼脂糖凝胶电泳40 min，得到一条长约589 bp的条带，与预期片段大小一致(图3)。

　　3 讨 论

　　真正意义上的hbv垂直传播是指病人的生殖细胞受hbv的感染,在受精时通过精子或卵子,将hbv带到胚胎使子代患病的一种传播方式[10]。20世纪70年代初，国外即有学者在乙型肝炎病人精液、阴道分泌物以及月经血内检测出hbsag, 证实精液有传染性。自从blumberg首次推测hbv dna有整合入宿主生殖细胞基因内传播至子代的可能性之后, 研究发现,人和动物的生殖细胞(包括精、卵细胞)内存在hbv dna。本实验室长期以来致力于对hbv垂直传播机制的实验研究。王培林等于国内外首次为hbv基因组在父子、母子之间的垂直传播提供了组织学和细胞学的证据;高慧婕等[5]应用阳离子转染剂介导转染体外培养的小鼠精细胞，采用精子载体法建立了hbv dna垂直传播小鼠模型;王冲通过构建hbv dna卵细胞载体,检测hbsag(+)乙型肝炎病人卵巢组织中hbv dna的存在，为乙型肝炎通过卵细胞垂直传播的观点提供了细胞与分子遗传学上的直接实验依据;张喆等[11]通过检测hbsag(+)病人卵巢肿瘤组织中hbv dna，为hbv经生殖细胞垂直传播感染提供了实验依据;欧阳奇琦等[12]通过动物实验首次证明破坏血睾屏障的完整性会使全部生精细胞易受hbv的感染。国内外相关研究已经证明，动物及人类的精子具有主动俘获外源dna的特性。但由于法律、伦理的限制与获取人卵母细胞存在困难，人类hbv感染是否存在通过真正意义上的垂直传播发生感染尚缺乏足够证据。在这一点上，实验动物研究已领先一步为hbv经由精子的垂直传播机制提供了直接证据。

　　随着分子生物学的发展，将重组基因转入动物细胞并表达已成为确定和分析功能基因产物的有力手段，大大促进了hbv的研究。本实验室保存的pcdna3.1gfp，原为商品化的真核表达载体，在体外培养的细胞中可进行稳定表达，其所含cmv早期启动子增强子，是经体外实验证实的最强的真核启动子之一，可使外源基因在哺乳动物细胞中高效表达;同时，cmv诱导的表达缺乏明显的组织特异性，表达水平不会严格受限于细胞类型。

　　不仅如此，pcdna3.1gfp真核表达载体还含有一种重要的报告基因——gfp基因。gfp最早于1962年在水母中被发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光。gfp的化学性质相当稳定，无光漂白现象(photobleaching),用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，gfp基因常被用作报告基因。本研究构建的pcdna3.1pres1gfp重组质粒内含gfp基因。转染了该质粒的精子在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，且转染前后精子数量、活力未见明显差异。一旦其与正常卵母细胞受精后，所发育成的2细胞胚也将能够观察到绿色荧光。用这种胚胎进一步检测hbv有关基因的表达，不但可以避免以往实验中的盲目性，而且节省实验成本，提高实验效率和实验结果的准确性。

　　限于时间、条件等因素，本次实验只进行至转染小鼠精子阶段。那么，在精子与卵细胞受精后的胚胎发育和出生后的个体发育过程中，由精子带入胚胎的hbv基因会经历什么样的变化?它们会在漫长的胚胎与个体发育过程中随着细胞分裂逐渐丢失吗?如果其不能丢失，那么存在于动物基因组中的hbv基因是否会引发乙型肝炎或导致肝细胞癌变?hbv在宿主染色体上的整合可否导致染色体不稳定从而诱发染色体畸变, 增加流产、死产和出生缺陷率?这些都是在未来的研究中亟待解决的问题。

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