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熊果酸对膀胱癌T24细胞生长的影响

发布时间:2015-07-10 08:46
熊果酸对膀胱癌t24细胞生长的影响

【关键词】 膀胱癌;熊果酸;血管内皮细胞;靶点

【摘要】 目的 探讨三萜类化合物熊果酸(ua)对人膀胱癌t24细胞增殖、迁移及裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其机制。方法 应用熊果酸处理体外培养的人膀胱癌t24细胞,四甲基偶氮唑蓝(mtt)比色法、细胞迁移法检测ua对t24细胞的增殖抑制效应;建立膀胱癌皮下移植瘤模型,观察ua对移植瘤的生长抑制作用。结果 体内﹑外实验结果显示:各治疗组ua能较明显抑制t24细胞增殖、迁移,并在48 h抑制作用明显。 在体内使裸鼠皮下移植瘤体积明显缩小,并表现具有一定的剂量时间依赖关系。结论 ua能明显抑制肿瘤细胞生成,其作用靶点可能为肿瘤新生血管内皮细胞。

【关键词】 膀胱癌;熊果酸;血管内皮细胞;靶点

 熊果酸(ursolic acid,ua),又名乌苏酸﹑乌索酸,属五环三萜类化合物,存在于白花蛇舌草﹑山楂,女贞子等许多天然药物中,具有保肝﹑降脂﹑免疫调节﹑抗感染﹑抗氧化及抗肿瘤等作用〔1〕。近年来研究发现,ua不仅对多种致癌物和促癌物有抵抗作用,而且对多种恶性肿瘤细胞生长有抑制作用〔2,3〕。本文采用不同浓度的ua处理人膀胱癌t24细胞,通过体外实验及体内裸鼠移植瘤模型,观察ua对膀胱癌t24细胞及裸鼠移植瘤生长抑制的影响,为开发一种新的治疗膀胱癌药物提供实验依据。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  ua,美国sigma公司,批号:77521;hyclone胎牛血清,赛默飞世尔生物化学制造(北京)有限公司,批号:nva0227;二甲基亚砜(dmso),美国amresco公司生产;噻唑蓝,北京鼎国生物技术有限责任公司;imdm培养基,美国海克隆生物化学制品;人vegf,美国 prospectany technogene 公司。co2培养箱,日本sanyo;超净工作台,苏州净化备厂生产;倒置显微镜,日本olympus公司;酶标仪,日本eyela公司。

  1.2 动物与细胞来源

  人膀胱癌t24细胞由吉林大学前列腺疾病防治研究中心惠赠;balb/c nu/nu裸鼠,6~8周龄,体重18~22 g,购自北京市维通利华实验动物技术有限公司。

  1.3 动物模型制备、分组及给药

  取对数生长期的t24细胞,用胰酶消化,调整活细胞浓度为5×106/ml,每只裸鼠腹股沟皮下接种上述单细胞悬液0.2 ml后,将裸鼠随机分为3组,每组10只,分别为对照组﹑姜黄素组及ua组。并在第2天开始给药,姜黄素及ua浓度分别为2、10 mg/kg,腹股沟皮下注射1次/d,对照组注射等量生理盐水,连续治疗21 d,末次给药后24 h处死动物,计算肿瘤体积的变化,体积=0.52×长径×短径×短径。

  1.4 t24细胞增殖活性的检测

  将t24细胞悬浮液加于96孔细胞培养板,每孔接种1×104细胞,同时添加vegf终浓度为1 ng/ml。每个处理设6个复孔,同时加入待测样品,ua终浓度分别为60、70、80 μmol/l;姜黄素浓度为13 μmol/l,对照组加入(dsmo);37℃,5% co2条件下,分别培养24、48、72 h后,每孔内添加终浓度为5 mg/ml mtt,在37℃,5% co2条件下继续培养4 h,弃含mtt的细胞培养液,并用pbs轻洗1~2次,每孔加入100 μl dmso轻微振荡器上振荡5 min,使其mtt被还原形成的蓝紫色结晶彻底溶解,用modeldg3022酶联免疫检测仪490 nm波长测od值,求出ic50值。

  1.5 t24细胞迁移的检测

  35 mm细胞培养皿接种5×105个t24细胞,单层培养至细胞覆盖率为95%左右,弃原培养液后,用灭菌双面剃须刀片在培养皿中央划一道线,再用细胞刮轻轻刮去一侧的细胞,并用新鲜imdm培养液轻洗培养皿内细胞3次,吸去残液,培养皿内添加新鲜培养液3 ml,同时添加vegf终浓度为1ng/ml和ua浓度分别为60、70、80 μmol/l的溶液,姜黄素浓度为13 μmol/l,在37℃、5% co2培养48 h,弃原培养液,甲醇浓度(99%)固定细胞10 min,用1 ml瑞氏色素染色,15~20 min后,用双蒸水冲洗2次,自然干燥或37℃恒温箱内干燥, 在刮痕整齐侧随机选3个视野拍照,细胞计数。

  1.6 统计学分析

  采用spss13.0统计软件处理,计量资料以x±s表示,多个样本的两组间比较采用snkq检验。

  2 结 果

  2.1 ua对膀胱癌t24细胞增殖影响

  正常对照组细胞呈正常对数生长,而ua及姜黄素组在24 h表现出增殖抑制作用,与对照组比较有显著差异(p<0.05),在作用48 h及72 h表现出极显著的增殖抑制作用,与对照组比较有极显著性差异(p<0.01),提示ua能显著抑制膀胱癌t24细胞增殖,并具有药物作用剂量效应和时间效应。见表1,图1。

  2.2 ua对膀胱癌t24细胞迁移的影响

  ua对膀胱癌t24细胞迁移(48 h)具有明显的抑制作用,与对照组比较有显著差异(p<0.01),并且其迁移抑制作用具有一定的时间剂量依赖关系。见表1,图2。图1 ua作用48 h后对各组膀胱癌t24细胞增殖抑制作用(×200) 图2 ua对膀胱癌t24细胞增殖抑制作用(48 h)(×200)表1 ua对膀胱癌t24细胞增殖抑制作用及细胞迁移的影响

  2.3 ua对裸鼠移植肿瘤抑制作用

  连续治疗裸鼠皮下移植肿瘤21 d后,ua能明显抑制肿瘤生长,与模型组比较有显著性差异(p<0.05),其抑制率为71.5%;在裸鼠体重方面,各组间鼠重无显著性差异,与实验前相比体重改变也不明显。见表2。表2 熊果酸对裸鼠肿瘤抑制作用

  3 讨 论

  近几年研究表明ua可通过细胞毒作用、增殖抑制、诱导凋亡、抑制肿瘤血管形成等多种机制发挥抗肿瘤作用、对人类卵巢癌细胞skov3系、mcf7乳腺癌细胞系等多种肿瘤均有较强的抑制作用〔4〕,本研究显示,随着ua药物浓度从60 μmol/l增加到80 μmol/l,作用时间从24 h至48 h,ua能明显抑制膀胱癌t24细胞增殖﹑迁移,并具有药物作用剂量效应和时间效应。与正常对照组比较有显著性差异。在瘤体边缘皮下注射ua浓度10 mg/kg,1次/d,连续治疗21 d,能使肿瘤体积明显缩小,抑制率达71.5%,与正常对照组比较有显著性意义。提示ua抑制血管退化同时,可以引起瘤体的消退,肿瘤体积明显缩小,体重未见明显变化,无异常反应及死亡。本研究通过体外实验与动物实验均证明了ua具有明显抗肿瘤血管生成的活性。并且在细胞水平和整体水平的结果具有一定的相关性,其作用机制可能直接作用靶点为新生血管内皮细胞,抑制肿瘤血管生成,使肿瘤处于无血管期,从而抑制肿瘤血管生成。ua有望成为一种新型的抗肿瘤药物。

【参考文献】
 1 tian z,lin c,zheng rx,et patoma activity and mechanism of ursolic acid and its derivatives isolated from aralia decaisneana〔j〕. world j gastroenterol,2006;12:8749.

  2 ikeda y,murakami a,ohigashi c acid,an antiand proinflammatory triterpenoid〔j〕.mol nutr food res,2008;52:2642.

  3 tsai sj,yin inflammaatory protection of oleanolic acid ursolic acid in pc12 cells〔j〕.j food sci,2008;73:1748.

  4 杨晓文,崔 明,莫 平.熊果酸对mcf7乳腺癌细胞生长的影响〔j〕.中华实验外科杂志,2009;4:43941.

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