EB病毒相关胃癌及鼻咽癌组织病毒主要潜伏期基因

【关键词】 疱疹病毒4型,人;胃肿瘤;鼻咽肿瘤;dna甲基化;启动区(遗传学)

【摘要】 目的 研究分析青岛地区eb病毒(ebv)相关胃癌及鼻咽癌组织中ebv主要潜伏期编码基因启动子甲基化状态。方法 采用甲基化特异性pcr(msp)及亚硫酸氢盐基因组测序法(bgs)，分析32例ebv相关胃癌及20例ebv阳性鼻咽癌标本中编码ebv核抗原ebnas基因的启动子cp、wp、qp以及lmp1和lmp2a编码基因启动子的甲基化状态。结果 ebv相关胃癌及鼻咽癌肿瘤标本中ebv编码基因启动子的甲基化状态与肿瘤细胞的潜伏感染类型一致：cp和wp呈高甲基化状态，而qp未发生甲基化;2种ebv阳性肿瘤标本中lmp1和lmp2a编码基因启动子甲基化状态有所不同，两者在ebv相关胃癌组织甲基化程度明显高于其在ebv阳性的鼻咽癌(χ2=19.15、11.01，p<0.01)。结论 甲基化是调控ebv主要潜伏期基因启动子活动的重要机制之一。

【关键词】 疱疹病毒4型,人;胃肿瘤;鼻咽肿瘤;dna甲基化;启动区(遗传学)

　the methylation status of the major ebv latency promoters in ebvagc and npc zhang xia, liu xia, jing yongzheng, et al (department of microbiology, qingdao university medical college, qingdao 266021, china); [abstract] objective to study and analyze the methylation status of major epsteinbarr virus (ebv) latency promoters in ebvassociated gastric carcinoma (ebvagc) and nasopharyngeal carcinoma (npc) in qingdao area. methods methylation status of specific cpg sites of cp, wp, qp, lmp1 promoter (lmp1p) and lmp2a promoter (lmp2ap) was systematically detected in 32 ebvagcs and 20 npcs by bisulfite genomic sequencing (bgs) and methylationspecific pcr (msp). results the methylation status of these promoters in ebvagc was consistent with npc. wp and cp were hypermethylated, whereas qp was unmethylated; the methylation status of lmp1p and lmp2ap in ebvagc was different from npc: the methylation rates of lmp1p and lmp2ap in ebvagc were significantly higher than those in npc (χ2=19.15,11.01;p<0.01). conclusion the methylation status of the ebv major latency promoters is one of important mechanisms in regulating the activities of these promoters.

　　[key words] herpesvirus 4, human; stomach neoplasms; nasopharyngeal neoplasms; dna methylation; promoter region (genetics)

　　eb病毒(ebv)属疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科成员，95%以上健康成人携带ebv，与人类多种肿瘤如鼻咽癌、burkitt淋巴瘤、hodgkin病、胃癌等密切相关[12]。www.lw881.com不同ebv相关肿瘤组织和ebv阳性细胞系中病毒基因的转录表达形式有所不同，在ebv潜伏感染细胞中，可表达的病毒基因有10多种，如ebv核抗原(ebna)1、2、3a、3b、3c和lp，潜伏膜蛋白(lmp)1、2a和2b，ebv编码的小rna(eber)1和2以及barf0的转录产物。根据ebv潜伏期基因表达形式不同分为潜伏ⅰ、ⅱ、ⅲ型3种潜伏类型。ebv相关胃癌和burkitt淋巴瘤组织均可以检测到潜伏期基因ebna1、ebers、lmp2a、barf0的转录表达，为潜伏ⅰ型。除了上述基因以外，在鼻咽癌组织、hodgkin病中还可检测到lmp1的表达者为ⅱ型潜伏。体外ebv永生化的b淋巴母细胞系(lcl)可检测到包括6种ebnas和3种lmps等在内的大部分ebv潜伏期基因的表达，称为ⅲ型潜伏。研究表明，ebv相关胃癌及鼻咽癌组织中病毒基因表现为限制性表达，推测ebv可能通过表观遗传机制调控病毒基因启动子，尤其是通过其甲基化状态来调控病毒基因的表达[3]。研究显示，ebv编码基因启动子序列中cpg位点甲基化可抑制相应基因的表达，但这些研究主要集中在淋巴细胞来源的ebv阳性肿瘤和细胞系。本实验选择上皮来源的ebv相关胃癌和ebv阳性鼻咽癌作为研究对象，检测其ebv主要潜伏期基因启动子甲基化状态，为深入探讨ebv相关肿瘤的发生机制及防治提供实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞系

　　ebv阳性akata、raji和b958细胞系由日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠，分别为潜伏ⅰ型、潜伏ⅲ型burkitt淋巴瘤细胞系，ebv永生化的潜伏ⅲ型lcl细胞系用作该实验的对照细胞。上述细胞用含有体积分数0.10的胎牛血清、105 u /l青霉素和100 mg /l链霉素的rpmi 1640营养液，于37 ℃、体积分数0.05的co2培养箱中培养。

　　1.2 肿瘤标本

　　新鲜胃癌组织和石蜡包埋鼻咽癌组织取自青岛大学医学院附属医院﹑蓬莱市人民医院和烟台毓璜顶医院。采用原位杂交检测石蜡组织切片中ebv编码的小分子非多聚腺苷酸eber1的转录[4]，筛选出32例ebv阳性胃癌和20例ebv阳性鼻咽癌标本。

　　1.3 dna提取

　　采用酚氯仿异戊醇抽提法常规提取新鲜胃癌组织dna，采用qiaamp dna ffpe试剂盒提取石蜡包埋鼻咽癌组织dna，具体操作步骤按试剂盒(qiaamp tissue kit, qiagen, hilden, germany)说明进行。

　　1.4 dna处理

　　取30 μl上述提取的组织dna (2～5 μg)，加33 μl新鲜配制3 mol/l的naoh溶液混匀变性，置37 ℃水浴15 min;将新鲜配制的亚硫酸盐溶液(2.4 mol/l 亚硫酸钠，ph 5.0～5.2;0.5 mmol/l 氢醌与3 mol/l naoh的混合液)333 μl加入变性dna中进行修饰，55 ℃避光孵育4 h。修饰后的dna脱盐纯化处理按照dna纯化试剂盒(qiagen, hilden, germany)说明操作步骤进行;脱盐纯化的dna溶于50 μl te缓冲液中，室温下静置5 min。再加入3 mol/l的naoh 5.56 μl，37 ℃水浴15 min，使其脱磺化基团。将纯化后dna溶解于100 μl te缓冲液中，-20 ℃保存备用[5]。

　　1.5 甲基化特异性pcr(msp)

　　以亚硫酸氢盐修饰的组织dna作为模板进行msp，甲基化特异性引物、未甲基化特异性引物以及msp产物大小见表1，其中wp和cp特异性引物参考文献[56]设计，qp、lmp1 和 lmp2a启动子特异性引物采用methprimer软件进行在线设计。 pcr反应体积为25 μl，包括dna模板2 μl，1.25 u热启动酶takara，1.5 mmol/l mgcl2，0.2 nmol/l dntp 和0.6 mmol/l引物。反应条件：95 ℃预变性5～10 min;然后95 ℃变性30 s，最适温度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共38个循环;最后72 ℃延伸10 min。扩增产物置20 g/l的琼脂糖凝胶上电泳，紫外线凝胶成像系统记录分析结果。ebv阳性akata、raji和b958细胞系dna 作阳性对照，ebv阴性ramos细胞dna作阴性对照。

　　1.6 亚硫酸盐基因测序

　　为进一步检测lmp1和lmp2a启动子区域cpg位点具体甲基化状态，并验证msp结果，参考文献设计引物行亚硫酸盐基因组测序(bgs)[78]，该引物序列位于msp引物序列外侧，见表2。pcr反应体积为25 μl，包括亚硫酸氢钠修饰的dna模板2 μl，1 u热启动dna聚合酶takara，1.5 mmol/l mgcl2，0.2 nmol/l dntp和0.6 mmol/l 引物。反应条件：95 ℃预变性5 min;然后95 ℃变性30 s，最适温度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共38个循环;最后72 ℃延伸10 min。扩增产物置20 g/l的琼脂糖凝胶上电泳，紫外线凝胶成像系统观察结果后送测序。表1 甲基化特异性pcr引物启引物类型核酸序列表2 bgs测序引物引物类型核酸序列b958对应序列退火温度

　　1.6 统计学分析

　　采用ppms 1.5[9]统计软件进行统计学分析,计数资料的比较采用校正χ2检验及χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 cp、wp及qp甲基化检测

　　msp检测结果显示，b958细胞中未检测到cp的甲基化，raji细胞中cp高甲基化，但在akata细胞系中同时检测到甲基化和未甲基化的cp。raji和akata细胞系中wp呈高甲基化，但在b958细胞系中则呈部分未甲基化现象;3种细胞系中均未检测到qp的甲基化。本实验检测的52例ebv阳性肿瘤组织均表现为cp和wp高甲基化状态，而qp呈低甲基化状态。msp检测3种细胞系和部分ebv阳性标本wp、cp及qp甲基化状态的电泳结果见图1～3。

　　2.2 lmp1基因启动子甲基化检测

　　msp检测结果显示，32例ebv相关胃癌组织中lmp1启动子均呈高甲基化状态;20例鼻咽癌标本检测到3种msp结果类型，其中包括m型9例(45%)、u型6例(30%)，m+u型5例(25%)，结果见表3。图4为msp检测2种ebv阳性细胞系和部分ebv阳性标本lmp1启动子甲基化状态的电泳结果。bgs检测结果显示：b958和akata细胞系lmp1编码基因启动子区的25个cpg位点均没有发生甲基化;ebv阳性肿瘤组织的检测结果与msp结果基本一致，除n43外，其余标本该区域25个cpg位点呈甲基化状态。见表4。

　　2.3 lmp2a基因启动子甲基化检测

　　msp检测结果表明，在84.38% (27/32)ebv相关胃癌和40%(8/20)的鼻咽癌标本中，lmp2a编码基因启动子表现为高甲基化，结果见表3和图5。bgs检测的结果显示，b958和akata细胞系lmp2a编码基因中启动子区的20个cpg位点均没有发生甲基化;ebv阳性肿瘤组织的检测结果与

　　q7、q31、y13a 为ebv阳性胃癌标本，n31、n43为ebv阳性鼻咽癌标本，akata、raji、b958为ebv阳性细胞系。m代表采用甲基化特异性引物m1/m2的pcr结果，u为采用甲基化特异性u1/u2引物的pcr结果。表3 msp检测ebv编码基因启动子甲基化状态启动子类型甲基化类型ebvagc(例)ebv阳性npc(例)

　　msp检测结果基本一致。见表4。bgs测序结果证实，5例msp结果呈u+m的ebv阳性肿瘤标本(q215、da53、da78、da93和n36)中，lmp2a启动子区域cpg位点呈部分甲基化。在3例ebv阳性胃癌标本(da53、da78和da93)中，lmp2a编码基因部分cpg位点存在2种不同的甲基化形式，即甲基化(c)与未甲基化(t)同时存在(图6)。

　　2.4 lmp1和lmp2a基因启动子在ebv阳性胃癌和鼻咽癌中的甲基化率

　　ebv阳性胃癌组织中lmp1和lmp2a基因启动子甲基化阳性率明显高于鼻咽癌组织，差异有显著性(χ2=19.15、11.01，p<0.01)。见表5。表4 bgs检测lmp1和lmp2a编码基因启动子cpg位点甲基化状态msp结q31、da53和da78为ebv阳性胃癌标本，n33、n39、n36均为ebv阳性鼻咽癌标本。

　　图5 msp检测lmp2a编码基因启动子甲基化电泳结果

　　图中序列276对应表4中的cpg位点是14，287对应的cpg位点是15，310、313、315对应的cpg位点分别是16、17、18。如图所见位点14、15存在两种波峰，提示c与t同时存在;位点16、17、18仅一种波峰，即c。表5 ebv阳性胃癌和鼻咽癌中lmp1p和lmp2ap甲基化率的比较组 别nlmp1p阳性(例)阴性(例)甲基化率

　　3 讨 论

　　基因表达调控区域的dna序列发生化学修饰可影响基因表达，dna甲基化是最重要的修饰形式之一。本实验证实，ebv相关胃癌和ebv阳性鼻咽癌组织中，病毒基因表达调控区dna的甲基化与ebv潜伏期基因的表达密切相关。

　　编码ebv核抗原ebnas的启动子包括wp、cp和qp，其中wp和cp为ebnas的共同转录启动子，可转录合成全部6种ebnas mrna，而qp为ebna1的专有启动子，选择性转录合成ebna1 mrna。ebnas在ebv相关胃癌及鼻咽癌组织中表达类型相同，仅ebna1表达，其表达受cp、wp和qp等3种启动子调控[10]。实验证实，wp和cp引物序列所含cpg位点的甲基化状态可很好地反映启动子的甲基化状态[56]。本研究msp检测结果显示，在ebv相关胃癌及鼻咽癌组织中wp和cp表现为高甲基化，而qp则未发生甲基化，表明潜伏ⅰ和ⅱ型ebv阳性肿瘤组织中ebna1的表达由未甲基化的qp启动[1112]。由此可见，启动子区域cpg位点甲基化状态与ebv基因表达密切相关，并呈反向关系，即dna甲基化一般抑制基因表达;而非甲基化一般与基因的活化相关。

　　通常认为在潜伏ⅲ型细胞系中，ebnas的表达受wp/cp调控，而qp处于沉默状态。本实验结果显示，在b958细胞系中wp、cp和qp均呈低甲基化状态，表明ebna1的表达由三者共同调控，其他ebnas的表达则由wp/cp调控。研究证实，raji细胞所有ⅲ型潜伏基因均表达，理论上6种ebnas mrna的转录表达是由wp/cp启动，但本研究显示raji细胞系中wp和cp呈高甲基化状态，提示ebna1的表达受qp调控，其他ebnas的表达不受wp/cp调控，推测raji细胞系中ebnas的表达存在其他调控机制。研究显示，ebv阳性bl细胞系在体外培养时易发生表型改变，如ebv核抗原表达的改变，早期传代病毒基因表达呈高度限制性，仅ebna1表达;随着传代次数的增多晚期至少表达9种不同的病毒蛋白(ebna1、2、3a、3b、3c，lp，lmp1、2a、2b)[1314]。我们的结果也显示，akata细胞系cp区域有少量cpg位点未发生甲基化，而且akata细胞系lmp1和lmp2a编码基因启动子的甲基化状态也反映出其在体外培养过程中发生了表型改变。推测体外细胞培养条件与人体内环境明显不同，缺乏免疫监视，对细胞系的研究可反映但不能代表原始肿瘤组织中ebv主要潜伏期编码基因启动子的甲基化状态，因此有必要对原始肿瘤组织标本进行研究。

　　bgs检测lmp1和lmp2a启动子区域cpg位点甲基化结果表明，2种上皮来源的ebv阳性肿瘤组织中存在病毒基因启动子不完全甲基化现象。1996年，robertson等[14]在对ebv阳性burkitt淋巴瘤和hodgkin病肿瘤组织中cp甲基化状态进行研究时就发现存在不完全甲基化现象。我们的前期研究结果也证实，lmp1和lmp2a在ebv阳性胃癌组织中表达不同，其中lmp1不表达，而lmp2a仅在部分标本中表达[15]。fahraeus等[16]采用免疫印迹法检测到lmps在约71%鼻咽癌组织(标本来源中国)中表达。本研究结果显示，2种ebv阳性肿瘤组织中lmp1和lmp2a编码基因启动子的甲基化状态有所不同，在ebv相关胃癌标本所有的lmp1基因启动子和绝大部分(27/32)lmp2a编码基因启动子呈高甲基化状态;而在鼻咽癌组织中，lmp1和lmp2a编码基因的甲基化程度明显下降，高甲基化率分别为45%和40%，表明ebv相关基因调控区域dna甲基化状态是基因表达的重要调节机制之一。bgs检测结果所示的部分ebv阳性胃癌组织标本中部分cpg位点u与m同时存在，我们推测其原因有两种：一是等位基因甲基化情况不一致;二是病毒基因组dna甲基化状态不同(病毒部分dna甲基化而另一部分dna未甲基化)。

　　总之，ebv阳性胃癌及鼻咽癌组织中，ebv主要潜伏期编码基因启动子区域cpg位点甲基化状态与其表达呈负相关，ebv基因的高甲基化状态有助于其逃避免疫活性个体的免疫系统的监视，并长期存在宿主细胞内，其在肿瘤的发生、发展中的具体作用机制有待于进一步研究。

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