esfatin1对脑干孤束核葡萄糖敏感神经元电活动影

【关键词】 nesfatin1;孤束核;神经元;葡萄糖;膜片钳术

【摘要】 目的 观察nesfatin1对脑干孤束核葡萄糖敏感神经元电活动影响，探讨其抑制摄食作用的可能机制。方法 采用全细胞膜片钳技术，在电流钳下，记录nesfatin1对孤束核葡萄糖敏感神经元电活动的影响。结果在孤束核中共记录到30个神经元，给予葡萄糖(5 mmol/l)灌流后，有18个(60.0%)对葡萄糖有反应，其中13个放电频率升高(gexc,t=2.509,p<0.05)，5个放电频率下降(ginh,t=12.79,p<0.01)，其余12个无反应。在13个gexc神经元，灌流nesfatin1 (10 nmol/l)后12个放电频率增加(t=3.346,p<0.01)，1个无反应。在5个ginh神经元，灌流nesfatin1 (10 nmol/l)后4个放电频率减少(t=11.877,p<0.01)，1个无反应。 结论nesfatin1能够调制孤束核葡萄糖敏感神经元的兴奋性，这可能是nesfatin1作用于孤束核抑制摄食的机制之一。

【关键词】 nesfatin1;孤束核;神经元;葡萄糖;膜片钳术

　　nesfatin1 influences electric activity of glucosesensitive neurones in nucleus of solitary tract song wenke, jiang zhengyao (department of physiology, qingdao university medical college, qingdao 266071, china); [abstract] objective to observe the effects of nesfatin1 on glucosesensitive neurons in nucleus tractus solitarius(nts), and explore the possible mechanisms of nts in controlling food intake. methods wholecell patchclamp technique was used to record the discharges of nts induced by nesfatin1 administration. results thirty nts neurons were treated with glucose, of which 18 (60.0%) responded to glucose with 13 as glucoseexcited (gexc) neurons and five as glucoseinhibited (ginh) neurons. the other 12 showed no response. nesfatin1 administration (10 nmol/l) increased the firing rates of 12 gexc neurons (12/13) (t=3.346,p<0.01), but decreased the firing rates of four ginh neurons (4/5) (t=11.877,p<0.01). one was found with no response. conclusion nesfatin1 can regulate the activity of gexc neurons, which might be one of the mechanisms of nts controlling food intake.

　　[key words] nesfatin1; solitary nucleus; neurons; glucose; patchclamp technique

　　nesfatin1是由日本群马大学森昌朋教授等于2006年发现的摄食调节肽[1]，大鼠脑室内注射nesfatin1能抑制摄食，nesfatin1通过阿片促黑色素细胞皮质素原(pomc)途径发挥抑制摄食的作用。我们以前研究了ⅰ、ⅱ型糖尿病病人空腹血浆nesfatin1的水平，结果显示ⅰ型糖尿病病人空腹血浆nesfatin1水平略高于正常人，但差异无统计学意义;ⅱ型糖尿病病人空腹血浆nesfatin1水平则均明显低于正常人和ⅰ型糖尿病病人[2]。脑干孤束核(nts)含有葡萄糖敏感神经元[3]，其中包括葡萄糖兴奋型神经元(gexc)和葡萄糖抑制型神经元(ginh)。许多研究证明，nts葡萄糖敏感神经元参与摄食的调控。 最近, maejima等[4]报道第三脑室注射 nesfatin1诱发的cfos的表达主要位于室旁核和nts。这种选择性的cfos表达，提示除室旁核之外，nts也是nesfatin1抑制摄食的重要靶点之一。本实验采用全细胞膜片钳技术，通过观察nesfatin1对nts葡萄糖敏感神经元的放电活动的影响，探讨nesfatin1在脑干nts抑制摄食的可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料

　　出生14 d的健康sd大鼠，体质量30～40 g，雌雄各半，由青岛市药检所提供。记录电极所用硬质玻璃毛坯由sutter instrument co(北京总代理)提供，氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、氯化钙(cacl2)、硫酸镁(mgso4)、碳酸氢钠(nahco3)、磷酸二氢钠(nah2po4)均系amresco公司产品，葡萄糖(glucose)、葡萄糖酸钾(kgluconate)、四乙酸(egta)、羟乙基哌嗪磺酸(hepes)、gtp、na2atp均为sigma公司产品。

　　1.2 溶液的配制

　　按文献[8]方法配制细胞外液和内液。细胞外液(即人工脑脊液， acsf)的成分为：124 mmol/l nacl，3 mmol/l kcl，1.3 mmol/l nah2po4，26 mmol/l nahco3，5 mmol/l hepes，2 mmol/l cacl2，1 mmol/l mgso4，10 mmol/l glucose，用1 mmol/l的naoh调节ph值至7.35～7.45。电极内液配方:130 mmol/l kgluconate，10 mmol/l kcl，1 mmol/l mgcl2，1 mmol/l cacl2，10 mmol/l hepes，1 mmol/l egta，4 mmol/l na2atp，0.5 mmol/l gtp，用1 mmol/l的naoh调节ph值至7.35～7.45。4 ℃冰箱保存备用。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 大鼠脑干nts脑片制作 大鼠乙醚麻醉后，迅速断头，剪开头皮，去除颅骨，于含体积分数0.95 o2和0.05 co2冰冷的acsf中取下脑干组织块，放于浸有acsf的滤纸上将脑干修块，然后同琼脂块一起用502胶水粘在切片槽的固定位置。槽中含有冰冷的acsf (0 ℃左右)，并不断通入含体积分数0.95 o2和0.05 co2的混合气体。使用振动切片机(world precision instrument)切出含有nts在内的250 μm厚的冠状切片，置于含体积分数0.95 o2和0.05 co2混合气体的acsf (33 ℃)中孵育1～2 h。

　　1.3.2 脑片固定与灌流 将脑片移至记录用灌流槽内，采用盖网固定法，即将稀疏的尼龙丝附着在铂金丝制成的u形框架上制成盖网轻覆于脑片，使脑片固定。使用恒流泵(hl2)持续向脑片浴槽中灌注含体积分数为0.95 o2和0.05 co2饱和气体的acsf，流量为2～3 ml/min，脑片浸没于液面下1～2 mm。给予药物时适当调节灌流速度，室温保持在24～26 ℃。

　　1.3.3 全细胞膜片钳记录 按常规全细胞膜片钳模式记录神经元, 当记录到nts神经元自发放电并稳定后开始实验。首先记录一段自发放电(通常为4～5 min)作为对照，然后灌流含葡萄糖(5 mmol/l)的acsf 5 min，接着用正常acsf冲洗。按文献[5]方法，将给予葡萄糖前后放电频率改变超过20%的神经元鉴定为葡萄糖敏感神经元。如果遇到对葡萄糖有反应的细胞，即待冲洗恢复后给予含nesfatin1(10 nmol/l)的acsf 5 min。将给予葡萄糖或nesfatin1前后放电频率变化超过20%的神经元列入统计。

　　1.3.4 检验电极记录位置 每次实验，将电极封接神经元位置进行观察并拍照，按照paxionswatson图谱进行核对，观察电极记录位置，位置不准确的资料不列入统计。

　　1.3.5 数据采集 实验中所有电刺激均从胞体内给予，模拟数字转换器采样频率10 khz，低通滤波频率3 khz;数据采集、记录采用heka实验室提供软件igor pro 501进行。

　　1.4 统计学处理

　　应用ppms 1.5[6]及spss统计学软件进行数据处理，结果以±s表示，数据间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 nts葡萄糖敏感神经元的鉴定

　　实验共记录到30个具有自发放电的神经元，灌流含葡萄糖(5 mmol/l)的acsf后，其中13个神经元(43.3%)放电频率明显增高，其平均放电频率从(0.63±0.2)hz增加到(1.73±0.52)hz(t=2.509,p<0.05)，用acsf冲洗后恢复，即鉴定为gexc(图1);12个神经元(40.0%)无明显反应;5个神经元(16.7%)放电频率明显减少, 其平均放电频率由(2.74±0.08)hz减少到(0.63±0.18)hz(t=12.79,p<0.01)，此即ginh(图2)。

　　2.2 nesfatin1对葡萄糖敏感神经元放电活动影响

　　在nts的13个gexc神经元中，灌流nesfatin1后发生兴奋反应的有12个(92.3%)，平均放电频率由(1.24±0.40)hz增加到(3.40±0.82)hz(t=3.346,p<0.01)(图1)，无反应的1个。在5个ginh神经元中，灌流nesfatin1后表现为抑制反应的有4个(80.0%)，其平均放电频率由(2.67±0.41)hz减少到(0.71±0.14)hz(t=11.877,p<0.01)，无反应的1个(图2)。

　　3 讨 论

　　关于摄食、能量平衡调控的机制十分复杂，许多肽类如促进摄食的orexin、神经肽y(npy)、刺鼠相关蛋白(agrp)，抑制摄食的leptin、黑色胞刺激素(αmsh)等都参与其中，相互协调、相互影响，从而使机体得以维持自身的能量稳定，进而将体质量严格控制在一个很小的波动范围内。nts是内脏传入神经进入中枢的门户，从胃肠道传来的感觉信号由迷走传入纤维首先在nts进行整合。

　　葡萄糖敏感神经元广泛地分布于下丘脑的多个核团，其中包括下丘脑弓状核(arc)、下丘脑外侧区(lha)、腹内侧核(vmn)和室旁核(pvn)，同时在脑干的nts等与摄食调节密切相关的区域也有分布，这些神经元可感知细胞周围葡萄糖浓度的变化, 启动或终止摄食行为，以维持机体能量平衡。

　　maejima等[4]报道第三脑室注射nesfatin1诱发cfos的表达主要位于室旁核和nts。这种选择性的cfos表达，提示除了室旁核之外，nts也是nesfatin1抑制摄食的重要靶点之一。形态学研究结果已证明,下丘脑pvn催产素神经元发出下行纤维支配nts[7]。shimizu等[8]报道，在小鼠腹腔注射nesfatin1，除显著抑制摄食之外，其诱发cfos的表达只出现在nts和最后区，而不出现在下丘脑arc，表明腹腔注射nesfatin1主要激活nts和最后区的神经元。本实验观察到，经全细胞膜片钳给予nesfatin1可以直接调制nts葡萄糖敏感神经元的兴奋性。ritter等[9]研究表明，nts葡萄糖敏感神经元属于脑干儿茶酚胺能a2细胞群。另外， bonnet等[10]研究表明，nts的nesfatin1神经元是酪氨酸羟化酶阳性的儿茶酚胺能神经元。因此，我们有理由推测，本实验记录的葡萄糖敏感神经元可能是nesfatin1神经元。nesfatin1可以调节nts葡萄糖感受神经元的兴奋性，显著改变其自发放电的频率，这也许可能是nesfatin1在nts 抑制摄食的部分机制之一。

　　综上所述，nesfatin1可以调制nts葡萄糖敏感神经元的兴奋性，这为nesfatin1在nts 抑制摄食提供了电生理学的依据。

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　　[4]maejima y, sedbazar u, suyama s, et al. nesfatin1regulated oxytocinergic signaling in the paraventricular nucleus causes anorexia through a leptinindependent melanocortin pathway[j]. cell metab, 2009,10(5):355365.

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　　[8]shimizu h, kinji i. the leptindependent andindependent melanocortin signaling system: regulation of feeding and energy expenditure[j]. j endocrinology, 2007,193:19.

　　[9]ritter s, bugarith k, dinh t t. immunotoxic destruction of distinct catecholamine subgroups produces selective impairment of glucoregulatory responses and neuronal activationp[j]. j com neurol, 2001,432:197216.

　　[10]bonnet m s, pecchi e, trouslard j, et al. central nesfatin1expressing neurons are sensitive to peripheral inflammatory stimulus[j]. neuroinflammation, 2009,6:2730.