胃癌组织线粒体DNA Dloop区的突变及其意义

【关键词】 dna,线粒体;胃肿瘤;突变;多态性,单核苷酸

【摘要】 目的 研究胃癌组织中线粒体dna(mtdna)dloop区突变情况及其在肿瘤发生和发展中的作用。方法 选择17例胃癌及相应正常胃黏膜组织, 应用聚合酶链反应(pcr)对其mtdna dloop区进行扩增并测序， 将测序结果与线粒体文库中的revised cambridge reference sequence (rcrs)进行对比分析。结果 17例胃癌组织中共发现mtdna dloop区存在175个多态性变异，其中8个(4.6%)为新发现的变异。8例(47.1%)胃癌组织中共发现13次突变;突变热点集中在hv1(23.1%)和hv2(53.9%)，并且hv2较hv1更易突变。mtdna dloop区突变率与胃癌分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、病人性别和年龄无关(p>0.05)。结论 mtdna dloop区尤其是其中的hv1及hv2是一个具有高度多态性和突变性的区域，在胃癌中突变率较高。

【关键词】 dna,线粒体;胃肿瘤;突变;多态性,单核苷酸

　dloop mitochondrial dna mutation in gastric cancer and its significance zhao yonggang, ji xiangrui, yang kun (department of pathology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china); [abstract] objective to study the mitochondrial dna (mtdna) mutation in dloop region in gastric cancer and its effect on tumorigenesis and development. methods polymerase chain reaction (pcr) and sequencing were applied to detect the dloop region of mitochondrial genome in 17 gastric cancer specimens and corresponding noncancerous tissue of the stomach. the sequence was compared with the revised cambridge reference sequence in mitomap. results in the tissue of 17 cancer cases, 175 polymorphisms were found in dloop region of mtdna, in which, eight (4.6%) were a new mutation. thirteen mutations were observed in eight (47.1%) of the 17 cases. hv1 (23.1%) and hv2 (53.9%) were mutational hot spots, with hv2 being more susceptible to mutation. the mutation in dloop region of mtdna was not associated with cell differentiation, depth of infiltration, whether or not with lymph not metastasis of the cancer, and not related with the gender and age of the patients. conclusion the dloop region of mtdna, especially of hv1 and hv2, is highly polymorphic and mutable, and the mutation rate is relatively high in gastric cancer.

　　[key words] dna, mitochondrial; stomach neoplasms; mutation; polymorphism, mononucleotide

　　核基因突变是肿瘤发生发展的研究热点。线粒体dna(mtdna)是细胞内惟一的核外dna，具有自我复制功能并控制一定的遗传性状，其突变在肿瘤发生中的作用日益受到关注。人mtdna为全长16 596 bp的双链闭环分子，由编码区和非编码区(包括dloop区)组成。编码区编码参与氧化磷酸化和生成atp的多肽，而非编码区是mtdna分子复制和转录的调控中心，故又称控制区。dloop区由于多态性较高，又称高变区，分为hv1(np 1602416383)、hv2(np 57372)及周边区域。本研究采用pcr产物直接测序的方法，对17例胃癌病人的癌组织及相应正常胃黏膜组织mtdna dloop区进行突变检测，以探讨mtdna dloop区突变与胃癌发生的关系，旨在寻找新的、有价值的肿瘤标志物，为肿瘤的临床诊断提供生物学指标。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源

　　2009年3—6月，青岛大学医学院附属医院手术治疗胃癌病人17例, 男11例，女6例，年龄47～81岁，中位年龄65岁。收集其新鲜胃癌组织及相应正常胃黏膜组织标本，每个标本质量约75 mg，置于-70 ℃备用。胃癌标本经病理诊断均为中低分化腺癌，其中中分化腺癌5例，低分化腺癌12例。相应正常组织镜下均未见癌细胞。

　　1.2 dna提取

　　癌组织及相应正常组织的dna提取用柱离心式小量组织细胞dna 同步抽提试剂盒,按照试剂盒说明书进行操作。提取的dna置于-20 ℃备用。

　　1.3 引物合成及pcr扩增

　　参照文献[1]设计扩增mtdna dloop区的引物。上游引物：5′ctaatacaccagtcttgtaaacc3′;下游引物：5′ggtgatgtgagcccgtctaaac3′。引物的合成与纯化由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。pcr反应采用50 μl反应体积。该反应体系包括：提取的dna 0.5 μg,0.12 μmol/l引物, 4种浓度均为0.2 mmol/l的dntp, 2 mmol/l的 mg2+, 1×pcr缓冲液(其中含50 mmol/l kcl，10 mmol/l trishcl, ph 8.0),1.25 u的takara premix taq (25 μl)。反应程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后于72 ℃延伸5 min。

　　1.4 pcr产物的鉴定、纯化和测序

　　取2.5 μl扩增产物，经10 g/l琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像仪检测，呈单一明亮条带(图1)，其长度为1 122 bp。pcr产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行纯化及测序。由于dloop区序列较长，故使用两对引物测序。见表1。

　　①dl 2000 dna marker;②1号样本胃癌组织mtdna dloop区扩增产物;③1号样本正常组织mtdna dloop区扩增产物;④2号样本胃癌组织mtdna dloop区扩增产物;⑤2号样本正常组织mtdna dloop区扩增产物;⑥3号样本胃癌组织mtdna dloop区扩增产物;⑦3号样本正常组织mtdna dloop区扩增产物。

　　图1 部分样本mtdna dloop区扩增产物电泳图表1 测序引物及其核苷酸顺序引物核苷酸顺序

　　1.5 测序结果分析

　　将测序结果序列拼接后，利用dnastar软件将胃癌组织和相应正常组织的mtdna dloop区序列进行比对，并且与人mtdna文库记录的revised cambridge reference sequence (rcrs)[2]进行比对。当肿瘤组织mtdna dloop区的核苷酸序列与相应正常组织的序列不同时，这种改变称为体细胞性突变。任何在肿瘤及相应正常组织mtdna dloop区同时存在的碱基序列改变，称其为多态性变异;然后再将每个变异与2009年10月26日发布的最新mtdna控制区序列多态性 (control region sequence polymorphism)文库中记录的数据进行对比分析，未在文库中发现者，视为新发现的变异。发现突变后，为保证序列结果的可靠性，用pcr重新扩增mtdna dloop区，并采用不同的引物再次测序以证实突变确实存在。

　　1.6 统计学分析

　　应用ppms 1.5[3]统计学软件进行数据处理，数据间比较使用四格表精确检验法。

　　2 结 果

　　2.1 胃癌病人mtdna dloop区的体细胞性突变

　　17例病人胃癌组织及相应正常组织mtdna dloop区测序结果表明，8例(47.1%)病人胃癌组织发生了13次突变，突变分布在11个核苷酸位点。13个突变中，9个为点突变，占总突变数76.9%;另见1个缺失突变及3个d310微卫星不稳(msi，指简单重复序列的增加或丢失)，msi占突变总数的23.1%。上述突变中，3个(23.1%)位于hv1，7个(53.9%)位于hv2。发生突变的样本编号、核苷酸位点、序列变化及突变类型见表2。发生突变的部分胃癌病人mtdna dloop区的碱基改变见图2。相应正常组织未见突变。表2 胃癌病人中mtdna dloop区的突变样本

　　2.2 胃癌病人mtdna dloop区的多态性变异

　　分别将17例胃癌病人的癌组织及相应正常黏膜组织mtdna dloop区测序结果与rcrs相比　较，显示mtdna dloop区的多态性变异数为175个，人均变异数为10.3个，其中8个(4.6%)为新发现的多态性变异。新发现的多态性变异的样本号、核苷酸位点及序列变化见表3。高频多态性的核苷酸位点、序列变化及发生的例数见表4。正常黏膜组织未见突变。

　　①5号病人正常组织mtdna dloop区489位碱基为t;②5号病人胃癌组织mtdna dloop区489位碱基为c;③9号病人正常组织mtdna dloop区303～315碱基序列为ccccccctccccc;④9号病人胃癌组织mtdna dloop区303～315碱基序列为cccccccctcccccc。表3 新发现胃癌病人mtdna dloop区的多态性变异样本号核苷酸位点序列变化11 54gc10 57ta7 101gt12 200ac9 477ta1516059ac1116129gt1716304ta 注：将结果与2009年10月26日发布的最新mtdna control region sequence polymorphism比较。表4 胃癌病人中高频率的mtdna dloop区的多态性核苷酸位点序列变化变化的样本数 注：多态性发生的样本例数≥5被定为高频率。

　　2.3 mtdna dloop区突变与胃癌临床病理特征的关系

　　mtdna dloop区突变与胃癌的分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、病人的性别和年龄均无关(p>0.05)。见表5。

　　表5 mtdna dloop区突变与胃癌临床病理特征的关系临床病理特征ndloop区突变(例(χ/%))p年龄(岁) ≤65125(41.7) >6553(60.0)0.93浸润深度 <浆膜32(66.7) ≥浆膜146(42.9)0.58淋巴结转移 有147(50.0) 无31(33.3)1.00性别 男116(54.5) 女62(33.3)0.62分化程度 中分化51(20.0) 低分化127(58.3)0.29

　　3 讨 论

　　癌症的发生不仅与细胞核内的基因改变相关，而且也与mtdna的突变密切相关。 与核基因组相比，mtdna更容易发生突变，其突变率为核基因组的10～100倍。胃癌、膀胱癌、骨肉瘤和宫颈癌等各种肿瘤组织中都检测到dloop区的突变[46]。

　　本研究结果表明，在17例胃癌病人中，共发现175个mtdna dloop区的多态性变异，其中8个为新发现者。可见mtdna dloop区是一个具有高度多态性的区域。由于anderson等[7]是在对西方人种mtdna测序后得出其核苷酸序列的，因此本研究发现的新多态性可能是人种和地域差异的反映。本研究还显示，47.1%的肿瘤具有mtdna dloop区突变，显示出较高的突变率。guo等[6]研究显示，骨肉瘤病人mtdna dloop区的突变率为70% (14/20); 陈道桢等[6]研究显示，子宫颈癌mtdna dloop区突变率为37.5% (9/24), 说明不同肿瘤mtdna dloop区的突变率不同。而一些文献报道，日本裔胃癌病人mtdna dloop区的突变率为4%[8]。其与前述较高突变率之间存在差异，说明同种肿瘤mtdna dloop区的突变率可有较大差异，这可能是由地域和人种的差别引起的。

　　除点突变以外，本研究也发现3个d310区的msi。线粒体也可以发生msi，称为mtmsi，是由于复制时mtdna链发生滑动错误导致重复修复所致。 d310是mtdna dloop区303315的polyc序列，是实体瘤的突变热点，其突变形式多为单碱基插入或缺失。parrella等[5]对56例恶性肿瘤的研究结果显示，d310总突变率为23%(13/56), 其在各种肿瘤中的突变率由高到低依次为子宫颈癌(35%)、膀胱癌(25%)、子宫内膜癌(16%)和乳癌(15%)，且突变同时存在于细胞学标本或细针抽吸活检标本中。可以认为，d310的msi普遍存在于肿瘤组织中。fliss等[9]的一项研究结果表明，mtdna突变是核内p53基因突变的19～220倍。因此，对mtdna突变情况进行分析，尤其是检测d310区的改变，可能会在肿瘤的细胞学诊断中起重要作用，尤其是对于形态学改变不明显或肿瘤细胞罕见的病例。

　　本文检测到突变主要分布于hv1(23.1%)和hv2(53.9%)，而且hv2比hv1更易突变，说明hv1和hv2是mtdna突变的热点。本文结果显示，mtdna dloop区突变与胃癌的分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、病人年龄和性别无关，提示mtdna dloop区突变可能是胃癌发生过程中一个早期事件，并伴随着胃癌的演进逐步发展。

　　kwast等[10]的研究结果表明，低氧情况下，mtdna损伤加重，影响细胞的能量代谢、分裂增生等，mtdna损伤与细胞凋亡和肿瘤的发生密切相关。而王宁等[11]的研究表明，低氧条件下，低氧诱导因子1(hif1)增多，可能会促进胃癌的演进。至于mtdna损伤和hif1的水平改变是否相关，则需进一步的研究。

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　　[11]王宁,付伟伟,徐静,等. 胃癌演进与异质化过程中hif1α 表达及其意义[j]. 青岛大学医学院学报, 2007,43(5):387389.