迷迭香酸对MPP+导致MES 23.5细胞损伤保护作用

【关键词】 迷迭香酸;1甲基4苯基吡啶;mes 23.5细胞

【摘要】 目的 观察迷迭香酸对1甲基4苯基吡啶阳离子(mpp+)所致mes 23.5细胞损伤的保护作用。方法 采用四甲基偶氮唑盐(mtt)检测方法，观察不同浓度的迷迭香酸对mpp+处理的mes 23.5细胞的保护作用。结果 10-9～10-6 mol/l的迷迭香酸对mes 23.5细胞无毒性作用(f=0.581，p>0.05)。200 μmol/l的mpp+可使细胞存活率降低(f=44.863，p<0.01)，而应用10-9～10-6 mol/l的迷迭香酸预孵育细胞后，能明显提高细胞的存活率(p<0.01)。结论 迷迭香酸能拮抗mpp+对mes 23.5细胞的毒性作用，具有一定的神经保护作用。

【关键词】 迷迭香酸;1甲基4苯基吡啶;mes 23.5细胞

neuroprotective effect of rosmarinic acid on 1methyl4phenylpyridinium induced cytotoxicity of the mes 23.5 cells du tingting, song ning, xie junxia, et al (state key discipline: physiology (in incubation), department of physiology, qingdao university, qingdao 266071, china); [abstract] objective to investigate the neuroprotective effect of rosmarinic acid on 1methyl4phenylpyridinium (mpp+)induced damage of mes 23.5 cells. methods mtt assay was used to observe the protection of rosmarinic acid, in different concentrations, on mpp+treated mes 23.5 cell. results rosmarinic acid (10-9-10-6 mol/l) did not produce any toxic effect on mes 23.5 cells (f=0.581,p>0.05). the cell viability decreased when treated with 200 μmol/l mpp+ (f=44.863,p<0.01). however, pretreatment with 10-9-10-6 mol/l rosmarinic acid significantly elevated the cell survival rate(p<0.01). conclusion rosmarinic acid can antagonize the toxic action of mpp+ on mes 23.5 cells, possessing a certain neuroprotective effect.

　　[key words] rosmarinic acid; 1methyl4phenylpyridinium; mes 23.5 cells

　　帕金森病(pd)是继阿尔茨海默病之后的第二大神经系统退行性疾病[1]。主要病理学改变是黑质致密带多巴胺(da)能神经元丢失及伴发的纹状体轴突末梢da的耗竭。pd的发病过程有许多致病因素参与，如炎症递质的产生、da分解过程中氧自由基的大量释放、线粒体的损伤、da的毒性代谢产物、细胞凋亡以及da神经元的氧化和抗氧化系统之间的失衡等[2]。氧化应激反应可能是pd发病机制中的关键因素之一。1甲基4苯基吡啶阳离子(mpp+)是一种经典的制备pd的神经毒性药物，它能诱导多巴胺能神经元的凋亡。本室以前的工作证实了10～1 000 μmol/l的mpp+可使细胞存活率明显降低。

　　迷迭香酸(ra) 是一种水溶性的含多酚羟基的酸性物质，1958年首次从迷迭香植物(rosmarinius officinalis) 中分离提取而得名[3]。ra具有抗氧化及清除自由基作用和抗炎、免疫调节、抗菌、抗病毒等多种生物活性。ra与不饱和脂肪酸竞争性与脂质过氧化物结合， 以终止脂质过氧化的连锁反应， 降低脂质过氧化速率。研究已证实，ra对维生素cnadph 诱发的脂质过氧化均有较强的抑制作用，作用比维生素e强几百倍至千余倍，ra还能抑制山梨糖醇引起的细胞活性氧物质(ros)和no及一氧化氮合酶的增加[4]。目前尚无ra对pd防治作用的系统性研究的报道，本实验拟采用四甲基偶氮唑盐(mtt)检测方法[5]，观察ra对mpp+处理的mes 23.5细胞的神经保护作用，以期为ra用于pd的防治提供可靠的实验依据。现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂

　　dmem/f12为gibco公司产品，其他的化学试剂均为sigma公司产品，ra由青岛大学医学院生物系提供。

　　1.2 细胞培养

　　mes 23.5细胞由美国休斯敦贝勒医学院神经科乐卫东教授友情馈赠，培养于含体积分数为0.05的胎牛血清、体积分数为0.02的satio溶液、质量浓度为10 g/l的l谷氨酰胺、105 u/l青霉素和100 g/l链霉素的dmem/f12培养液中，置于体积分数为0.05的co2培养箱中传代培养，每2～3 d传代一次。

　　1.3 mtt方法检测细胞存活率

　　用新鲜配制的dmem/f12培养液漂洗细胞1次，吹打制成单细胞悬液后离心，用dmem/f12培养液稀释成1×108/l的细胞悬液，每孔100 μl接种于铺有多聚l赖氨酸的96孔板中，每孔细胞数量约为1×104个，置于37 ℃、体积分数为0.05的co2培养箱中培养24 h，然后，加入不同浓度的ra(10-9、10-8、10-7、10-6mol/l)，正常对照组以配制的无血清dmem/f12培养液替换，置于37 ℃、体积分数为0.05的co2培养箱中预孵育30 min，然后加入mpp+(终浓度为200 μmol/l)与ra共孵育24 h。细胞培养结束后每孔加入5 g/l的mtt20 μl， 37 ℃培养箱中培养4 h，弃上清后每孔加入二甲基亚砜100 μl，用酶标检测仪测定570 nm处吸光度值，以此来反映细胞的存活率。每组实验重复5次，取平均值来进行统计学分析。

　　1.4 统计学处理

　　本文实验结果以±s表示，采用spss 12.0软件进行统计分析，以单因素方差分析后studentnewmankeuls检验进行mes 23.5细胞存活率的比较。

　　2 结 果

　　2.1 ra对mes 23.5细胞存活率的影响

　　正常对照组和以10-9、10-8、10-7、10-6mol/l的ra处理组mes 23.5细胞存活率分别为1.00±0.00，0.87±0.16，0.96±0.15，0.95±0.14，0.90±0.13。不同浓度的ra处理mes 23.5细胞后，细胞的存活率与正常对照组相比，差异无显著性(f=0.581，p>0.05)。

　　2.2 ra对mpp+导致的mes 23.5细胞损伤的保护作用

　　正常对照组mes 23.5细胞存活率为1.00±0.00，mpp+孵育组的细胞存活率为0.69±0.03，10-9、10-8、10-7、10-6mol/l的ra和mpp+共孵育组细胞存活率分别为0.84±0.02，0.85±0.04，0.81±0.03，0.78±0.06。mpp+孵育组细胞存活率明显降低，与正常对照组相比较差异有极显著意义(f=44.863，p<0.01)。10-9、10-8、10-7、10-6mol/l ra和mpp+共孵育组细胞存活率明显高于mpp+孵育组，差异均有极显著意义(p<0.01)。10-9、10-8、10-7、10-6 mol/l ra和mpp+共孵育组细胞存活率与正常对照组相比差异有极显著意义(p<0.01)。而不同浓度的ra和mpp+共孵育组之间比较差异无显著性(p>0.05)。

　　3 讨 论

　　ra是天然的抗氧化剂，具有抗炎、抗氧化、清除自由基与免疫抑制等多种活性且作用确切，可用于治疗与自由基有关的多种疾患，所以对其进行研究开发具有一定的意义。1999年，有研究者证实了ra可抑制中性粒细胞呼吸爆发和脂质过氧化及通过减少细胞内钙离子浓度而抑制溶酶体的释放，还能抑制内皮细胞调节的低密度脂蛋白的氧化[6]。ra可以抑制紫外线吸收引起的ros产生的增加，表现为细胞内脂质过氧化反应降低，atp和还原型谷胱甘肽增加。此外，ra还可以抑制caspase3的激活。ra通过清除自由基作用而被氧化成醌式，如ra对h2o2引起的大鼠红细胞溶血和脂质过氧化有显著的抑制作用，对由vit cnadph 或fe2+半胱氨酸诱发的大鼠脑、肝、肾微粒体的脂质过氧化都有很强的抑制作用。还有研究结果认为，ra清除自由基和抗氧化作用亦是它的主要抗炎作用机制之一[7]。业已证实，ra可以通过抗氧化作用来抑制alpha突触核蛋白纤维的生成，还可以降解已形成的alpha突触核蛋白纤维，在老年性痴呆的防治中有着重要的作用。

　　本实验证实，10-9、10-8、10-7、10-6mol/l ra本身对细胞的存活率没有影响，并且ra能拮抗mpp+导致的细胞毒性，具有一定的神经保护作用。我们在以前的实验中研究了不同剂量的迷迭香酸对mes 23.5细胞的影响，显示高浓度的迷迭香酸(比如10-3 mol/l ra)对细胞有毒性作用。因此，我们在本次研究中选用了对细胞存活率没有影响的浓度来观察其对mpp+处理的mes 23.5细胞的保护作用。mes 23.5细胞是一种由大鼠中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤胶质瘤细胞株18tg2经细胞融合技术得到的一种da能细胞系，这种细胞同时具有胶质瘤和中脑黑质da能神经元的特性[8]。本实验室前期的工作表明，mpp+可通过诱导凋亡对mes 23.5细胞产生毒性作用，mpp+可以特异性损伤线粒体，导致线粒体跨膜电位的降低，细胞内ros的生成增加，而ros的产生又加重了线粒体的损伤，如此循环，最终导致细胞的凋亡。本实验证实了ra能对抗mpp+诱导的mes 23.5细胞的损伤。ra发挥其保护作用的可能机制主要有两点：一是ra可能通过抗氧化应激发挥保护作用。氧化应激在pd中起到重要作用，脑内富含da的区域容易受到氧化应激的影响，因为da本身的代谢导致了ros的产生，包括过氧化氢和羟自由基[9]。线粒体不仅是ros的主要靶点还是ros产生的主要部位，这与氧化分子破坏的主要靶点一致[10]。ra可能通过减少ros的产生，保护线粒体功能，发挥抗氧化应激的作用。二是ra可能通过抗凋亡发挥保护作用。本室以前的工作证实了mpp+可诱发细胞的凋亡过程，因此我们推断ra可能通过抗凋亡机制保护mes 23.5细胞的功能。本实验证实了ra对mpp+导致的mes 23.5细胞损伤确实有保护作用，其发挥作用的机制仍待进一步探讨，为该药开发成为预防和治疗pd的新药提供了实验依据。

【参考文献】
　　[1]jellinger k. pathology of parkinson’s syndrome[m]. handbook of experimental pharmacology, 1989,88:47112.

　　[2]gelinas s, martinoli m g. neuroprotective effect of estradiol and phytoestrogens on mpp+induced cytotoxicity in neuronal pc12 cells [j]. j neurosci res, 2002,70:9096.

　　[3]scarpati m l, oriente g. isolamento e costituzione dell’acido rosmarinico[j]. ric sci, 1958,28:23292333.

　　[4]aquilano k, filomeni g, di renzo l, et al. reactive oxygen and nitrogen species are involved in sorbitolinduced apoptosis of human erithroleukaemia cells k562[j]. free radic res, 2007,41(4):452460.

　　[5]钱冬萌,谢俊霞. 乌鸡白凤丸对aβ140诱导的大鼠海马神经元凋亡的保护作用[j]. 青岛大学医学院学报, 2007,43(1):14.

　　[6]chen s z, fu y p, wu r s. effects of rosmarinic acid on free radical production and lysosomal enzyme release from rat peritoneal neutrophils [j]. acta pharm sin, 1999,34:881885.

　　[7]psotova j, svobodova a, kolarova h, et al. photoprotective properties of prunella vulgaris and rosmarinic acid on human keratinocytes[j]. j photochem photobiol b, 2006,84(3):167174.

　　[8]crawford g d j r, le w d, smith r g, et al. a novel n18tg2 x mesencephalon cell hybrid expresses properties that suggest a dopaminergic cell line of substantia nigra origin [j]. j neurosci, 1992,12(9):33923398.

　　[9]jenner p. oxidative stress in parkinson’s disease[j]. annals of neurology, 2003,53(suppl 13):s26s38.

　　[10]lotharius j, brundin p. pathogenesis of parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alphasynuclein[j]. nat rev neurosci, 2002,3(12):932942.