黄芪汤中多糖的提取及含量测定研究

　黄芪为豆科植物，具有补气固表、利尿托毒、排毒敛疮、利水消肿、增强免疫的功能，药理实验表明，黄芪多糖作为一种免疫抑制剂，具有保护急性心肌缺血，对抗心率失常，改善微循环的作用；白术多糖能调节免疫功能；甘草多糖为甘草重要的活性成分之一，具有抗补体和促有丝分裂等免疫调节作用以及抗肿瘤、抗病毒等作用[1]。因此，多糖是黄芪汤中的主要药效成分之一。目前，黄芪、白术、甘草单味药中多糖的提取分离和含量测定的报道较多[2-4]，我们采用蒸馏水煮沸提取黄芪汤中的多糖，用苯酚-硫酸法对多糖进行含量测定，为黄芪汤的进一步研究奠定基础。
　　1 仪器与试药
　　VIS- 723G可见分光光度计，LD -510离心机，101A -2型恒温干燥箱，HH -2数显恒温水浴锅，FA1004N电子天平，SHZ -Ⅲ型循环水真空泵。防己、黄芪、甘草、白术药材葡萄糖对照品（含量测定用，纯度大于99%）购自中国药品生物制品鉴定所；无水乙醇、苯酚和浓硫酸等试剂均为分析纯。
　　2 方法与结果
　　2.1 多糖的提取取工艺研究
　　2.1.1 多糖的提取：取黄芪汤全方14g（黄芪5g、白术3g、甘草2g，下同），各加12倍量水煎煮3次，每次1.5h，用4层纱布过滤，合并滤液，浓缩为1：0.8（1g生药相当于0.8mL药液），加入95%乙醇，使含醇量为70%，低温静置12h以上，以4000r/min，离心10min，弃去上清液，取沉淀用水溶解，再离心一次，取上清液浓缩至1：08，加入95%乙醇，使含醇量为80%，低温静置12h以上，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤，抽干，在恒温干燥箱50℃干燥，得多糖提取物[2]。
　　2.1.2 加水量的考察：称取黄芪汤药材14g共3份，第一份加8倍量水煎煮2次，每次2 5h，第二份加l2倍量水煎煮3次，每次1.5h，第三份加25倍量水煎煮2次，每次2h，分别用4层纱布过滤，合并滤液，其余按“2.5”项下的操作，加水量为药材量12倍时，多糖提取率达9. 7%.是较高的。
　　2.1.3 药液相对浓度的考察：称取黄芪汤药材42g（、.黄芪15g.白术9g、甘草6g），加12倍量的水煎煮3次，每次1.5h后，过滤浓缩，滤液平均分成三份，分别浓缩为1：0.8、1：1、1：1.2，分别加入95%乙醇，使含醇量为70%，其余按“2.5”项下的操作。结果多糖含量分别为12.2%、8.6%、4. 3%，从实验结果可知，当药液相对浓度为1：0.8时，多糖提取率较高。
2.2 多糖的含量测定研究
　　2.2 1 供试品溶液的制备：精密称取多糖提取物0. lg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.1mg/mL溶液，精密移取2.5mL稀释液，置50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，振荡摇匀，备用[5|。
　　2.2.2 标准溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100.6mg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密吸取溶液10mL，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.100 6 mg/mL的葡萄糖标准溶液。
　　2.2.3 最大吸收波长的选择：精密移取葡萄糖标准溶液和供试品溶液各1.0mL，分别置10mL具塞试管中，加蒸馏水使成2.0mL，精密加入1.0mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0ml浓硫酸，静置5min后，置沸水浴中反应15min后取出并放至室温，于400-600mm范围内扫描。测得两者的最大吸收波长均为为490mm。
　　2.2.4 标准曲线的制备：分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置25mL具塞试管中，加蒸馏水使成2.0mL，精密加入1.0mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0mL浓硫酸，静置5min后，置沸水浴中反应15min后取出并放至室温，于490mm处测定吸光度（ A）。以吸光度A对浓度C进行线性回归，计算回归方程A=60. 047C -0.000 6.r=0. 999 7。浓度C在0.001 2一0.001 3 mg/mL范围内线性关系良好。
　　2.2.5 精密度试验：精密移取对照品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下操作，测定吸光度，连续测定6次，吸光度的RSD为0.08%，表明仪器精密度良好。
　　2.2.6 稳定性试验：精密移取供试液1. 0mL按“2.2.4”项方法操作，测定吸光度。每隔30min测定一次，连续2.5h考察其稳定性，吸光度的RSD为1.6%，结果表明样品溶液在2.5h内显色稳定。
　　2.2.7 重复性试验：称取黄芪汤剂的药材共14g，按“2.1.1”项下方法操作，得多糖提取物1. 882 9g，精密称取多糖提取物0.1g，共6份，按“2.2.1”项下操作配制供试品溶液，分别精密移取供试品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下方法测定，并计算多糖提取物中多糖相对含量，平均为92.7%，再换算成黄芪汤剂中多糖的含量，平均为12.4%，RSD为2.6%，结果表明该方法重复性良好。
　　2.2.8 加样回收试验：精密称取同一多糖提取物0.05 g，共6份，分别精密加入葡萄糖标准品适量，其余按“2.2.7”项下操作，计算多糖回收率，结果见表。
　　表1 回收率试验测定结果
　　2.2.9 祥品含量测定
　　称取黄芪汤剂的药材14g，共6份，按“2.1.1”项下方法操作，得多糖提取物，精密称取多糖提取物0. 1g，按“2.2.1”项下操作配制供试品溶液，分别精密移取供试品溶液1.0mL，按“2.2.4”项下方法测定，求得多糖的含量，实验结果见表2：
　　表2黄芪汤的多糖含量测定结果
　　3 讨论
　　黄芪多糖属于极性大分子化合物，主要由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖组成。研究发现，多糖的生物活性与分子量、溶解度、粘度、一级结构和高级结构有关，因此多糖提取时应根据其有效成份的不同来设计工艺路线。 试验中同时比较测定了黄芪、白术、甘草各单味药材中多糖的含量，结果显示黄芪汤中多糖的平均含量为13. 1%，全方汤剂的多糖含量略高于黄芪、白术、甘草单药汤剂的多糖含量之和。
　　有关文献报道[5]用不同浓度的汤剂进行醇沉时，浓度太高或太低都会实验结果，本实验孝察显示药液相对浓度为1：0.8时，多糖提取率较高。采用水煮醇沉法报提取黄芪汤中的多糖是可行的，但步骤比较多，要求操作规范。实验过程应注意：（1）取样要均匀；（2）在醇沉时，加乙醇的速度和振摇频率要控制得当；（3）加入苯酚硫酸显色剂时，应悬空移液管，垂直快速加入。
　　杨莲芳、刘珍等[5]复方制剂中的多糖进行试验，表明样品经纯化处理后用苯酚-硫酸法，更适用于多糖含量测定，本实验由于时间有限，没有对提取的多糖进行纯化，所以实验结果重复性稍差。在后继续研究时，可考虑对多糖进一步纯化以便提高重复性。
　　参考文献
　　[1]季宇彬主编，中药多糖的化学与药理[M].北京：人民卫生出版社，2005.
　　[2]邓瑞生，张述斌，王必慧，等，黄芪多糖的提取和含量测定研究[J]，国外畜牧学报，2009，12（1）：50-51.