青霉胺对巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶的影响的

　动脉粥样硬化是一种发生在血管壁的慢性炎症过程[1]，在高血脂、高血压、遗传、年龄等全身因素和血流动力、毒素、病毒等局部因素作用下，内皮细胞损伤，低密度脂蛋白（LDL）渗出到内皮下聚集并氧化变性，刺激局部内皮细胞表达黏附因子趋化因子配体2（chemokine ligand 2，CCL-2）等促进血液中单核细胞等的黏附和渗出，并分化为巨噬细胞[2]。巨噬细胞在动脉粥样硬化过程中发挥关键作用，一方面其吞噬LDL转化为泡沫细胞，并坏死形成脂质核；另一方面巨噬细胞是粥样斑块中细胞成分的主要部分，可分泌多种细胞因子及NO等改变局部环境，影响斑块的稳定和疾病的发展[3]。诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是炎症的重要标志，其可催化产生大量NO，NO在免疫应答中有着复杂而且呈双面性的作用，同时NO供体也是应用多年的冠心病治疗药物，NO在免疫应答中的双面性作用对动脉粥样硬化病程有什么样的影响？本研究通过观察S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺（S-nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine，SNAP）对RAW 264.7巨噬细胞内iNOS mRNA和蛋白表达的影响，旨在探讨NO对巨噬细胞的影响及其在动脉粥样硬化发展过程中的作用，为临床治疗冠状动脉粥样硬化提供新的依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要试剂
　　RAW 264.7单核巨噬细胞购自中国科学院上海细胞库，高糖DMEM培养基（美国HyCLone公司）。新生胎牛血清购于杭州四季青生物有限公司。SNAP购自美国Sigma公司。PCR引物合成、RNA提取及逆转录试剂盒均由大连宝生物试剂公司提供。兔抗小鼠NOS2多克隆一抗（sc-650）购自Santa公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购于Raygene 公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养及实验分组 RAW 264.7巨噬细胞用含10 %胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，0.25%胰酶消化、传代，2～3代后处于对数生长期的RAW 264.7细胞用于实验。实验分组：①空白对照组：完全培养基；②不同浓度SNAP组：分别加入30、100、300、400、500 μmol/L的SNAP，作用于巨噬细胞24 h。
　　1.2.2 RT-PCR检测iNOS mRNA的表达 收集各组细胞，按照RNA提取试剂盒说明提取总RNA，测定总RNA的量及纯度。取2 μl（500 ng）总RNA逆转录合成cNDA，再取2 μl逆转录产物采用SYBR Ⅱ嵌合荧光法直接进行PCR循环。iNOS的引物序列：上游引物5′-GCTGAACTTGAGCGAGGA，下游引物3′-ACTCAGTGCCAGAAGCTGGA，产物长度185 bp；β-actin的引物序列：上游引物5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC，下游引物3′-ATGGAGCCACCGATCCACC，扩增长度171 bp。两步扩增法：条件为：一个循环95℃ 10 s；40个循环，95℃ 5 s，60℃ 31 s。结束后进行溶解曲线分析，通过观察溶解曲线是否为单一峰评价PCR反应产物的特异性，每个反应设置2个复孔。所有RT-PCR实验至少重复3次。RT-PCR统计分析采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt=各组ΔCt（目的基因-管家基因Ct）-对照组ΔCt（目的基因Ct-管家基因Ct）。
　　1.2.3 Western blotting检测iNOS蛋白的表达 收集各组细胞，加入裂解液裂解细胞，提取总蛋白。用BCA法进行蛋白定量。用6%SDS-聚丙烯胺凝胶进行电泳分离、每孔的上样量为100 μg，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，用一抗iNOS（1∶300）或β-Actin（1∶10000），4℃过夜，PBST洗膜10 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000），室温孵育1 h，PBST洗膜15 min×3次。把膜放于WEST PICO 2 min，压片，显影，检测特异性蛋白条带。用软件ImageJ进行灰度分析，将各组的iNOS分别于内参β-Actin的光密度值进行比较，两者的比值代表iNOS蛋白的表达。
　　1.3 统计学分析
　　采用SPSS 18.0进行统计学分析，所有数据采用x±s表示，实验数据组间比较采用单样本或两样本t检验，两样本t检验时检验方差齐性，总体方差不齐时采用Cochran﹠Cox法，以P<0.05为差异有统计学意义。
　2 结果
　　2.1 巨噬细胞形态
　　显微镜下RAW 264.7巨噬细胞以类圆形或多边形为主，有1个或两个伪足伸出（图1）。
　　A
　　B
　　图1 显微镜下RAW 264.7巨噬细胞
　　A.10×10倍倒置显微镜下未贴壁巨噬细胞照片；B.10×20倍倒置显微镜下贴壁巨噬细胞照片
　　2.2 SNAP对RAW 264.7巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响
　　不同浓度SNAP作用于RAW 264.7巨噬细胞24 h后与空白对照组比较，各干预组iNOS mRNA的表达均明显下降（P<0.05）（图2）。
　　图2 SNAP对RAW 264.7巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响
　　与对照组比较，*P<0.05
　　2.3 SNAP对RAW 264.7巨噬细胞内iNOS蛋白含量的影响
　　与空白对照组比较，不同浓度（30、100、300 μmol/L）SNAP组iNOS蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），且降低和浓度相关（图3、4）。
　　图3 SNAP对RAW 264.7巨噬细胞内iNOS蛋白的影响
　　1.对照组；2.30 μmol/L SNAP干预组；3.100 μmol/L SNAP干预组；4.300 μmol/L SNAP干预组
　　图4 SNAP对RAW 264.7巨噬细胞内iNOS蛋白含量的影响
　　与对照组比较，*P<0.05
　　3 讨论
　　巨噬细胞分泌的NO是炎症过程中的重要物质[4]，本实验证实其在发挥杀菌及杀死肿瘤细胞的作用的同时，可以抑制巨噬细胞自身iNOS mRNA基因转录，降低iNOS的合成而发挥负反馈作用。
　　NO在体内是一种参与了多种病理生理过程的信号信使分子，包括神经传递、炎症、免疫反应及心血管系统生理病理[4]。NO除了扩张血管作用外对动脉粥样硬化的影响是多方面的[5]，Martinet等[6]证实NO可以选择性促进巨噬细胞凋亡而使动脉粥样斑块更加稳定。体内的一氧化氮合酶（NOS）可以将L-精氨酸转化为NO和瓜氨酸，其可分为构成型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase，cNOS）和iNOS。cNOS在机体内持续结构性的表达，包括内皮细胞型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）和神经型一氧化氮合酶（neuronal nitricoxide synthase，nNOS）[7]。iNOS分布广泛，炎症因子、LPS、细菌内毒素等刺激后在多种组织、细胞中都可以检测到，包括巨噬细胞、单核细胞、肺泡 上皮细胞等，在炎症或免疫应答过程中IFN-γ、TNF-α、LPS、内毒素等诱发巨噬细胞高表达iNOS产生大量的NO，NO是脂溶性小分子物质，渗透性强，是炎症反应局部内重要的活性物质[8]，其在杀灭肿瘤细胞、入侵的微生物等的同时，也能抑制淋巴细胞增殖、TNF-α、IFN-γ炎症介质的分泌而发挥负向免疫调节功能，并可造成自身组织的损伤[4]。Assreuy等[9]的实验证实NO可以直接抑制iNOS活性。本实验进一步证实NO可抑制iNOS基因的转录及iNOS蛋白的表达，而不是仅仅抑制iNOS酶活性发挥负反馈作用。
　　iNOS基因位于17号染色体，由26个外显子、25个内含子组成，约37 kb大小作用是由于其抑制IFN-γ等炎症因子分泌引起还是直接作用于基因序列引起？可能两者都有关，因为有实验报道NO可以引起核苷酸序列破坏。不管怎样，其具体机制还需要更多的研究。
　　动脉粥样斑块内存在大量的免疫细胞，以巨噬细胞为主，在正常的动脉血管壁内监测不到NO，但在动脉粥样斑内存在较高浓度的NO[12-13]。我们的研究证实NO可以抑制巨噬细胞iNOS的表达，这种负反馈机制可能是调节局部炎症平衡的机制之一。同时巨噬细胞可分为不同亚型，其作用不同甚至相反，主要有促炎型的M1亚型及修复型的M2亚型[3，14]，iNOS也是M1亚型的分化标志[15]，NO抑制巨噬细胞iNOS的表达，可能会促进巨噬细胞向M2亚型分化。有实验利用人颈动脉斑块切片，观察到在粥样斑块肩部M1Φ占明显优势，只有少数有限的M2Φ存在，在斑块内部和纤维帽处两型之间没有明显差别[16]。推测粥样斑块内巨噬细胞亚型分化的调整，改变了粥样斑块的稳定性，最终影响动脉粥样硬化的病程[3，17]。
　　已有实验报道NO除了扩血管作用外，对动脉粥样硬化病程的作用是多样的[5-6]，本实验证实NO能抑制巨噬细胞iNOS的表达而发挥负反馈作用，这种作用可能也会影响动脉粥样硬化病程，这方面还需要进行更多的研究。
　　[参考文献]
　　[1] Hansson sclerosis——an immune disease：the Anitschkov Lecture 2007[J].Atherosclerosis，2009，202（1）：2-10.
　　[2] Libby P，Ridker PM，Hansson ss and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J].Nature，2011，473（5）：317-325.
　　.J Innate Immun，2012，4（5-6）：498-508.