RNA干扰致FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞的效应分析

　人FRAT1（frequently rearranged in advanced T cell lymphomas-1）基因最初被认为是T细胞淋巴瘤的原癌基因，是FRAT（frequetly rearranged in advanced T cell lymphomas）家族中的一员载体。每孔细胞转染所需双链shRNA和Lipofectamine 2000分别是1 μl，0.8 μg。按Lipofectamine 2000使用说明进行细胞转染。转染24 h后每孔细胞分成3孔，分别加入G418（600 μg/ml）；以后每3天更换培养基和G418。等未转染对照孔细胞都被杀死后，终止G418筛选，用含10%FBS培养基培养具有G418抗性细胞，增殖到一定数量后，将其转到培养瓶中培养，定期用G418清除遗失抗性的细胞。另外同时筛选转染表达无功能shRNA质粒和转染pSINsi-hu6载体的HT29细胞作为阴性对照。　1.2.4 HT29细胞总RNA 抽提及RT-PCR 总RNA抽提按Trizol产品说明书进行。操作步骤如下：用PBS清洗两遍收集的细胞，RNA Trizol裂解，氯仿抽提，异丙醇、75%乙醇沉淀、洗涤后，溶解于DEPC水中，测定RNA浓度。利用提取的RNA进行RT-PCR，获得cDNA。RT-PCR按宝生物工程公司的试剂盒说明操作。RT条件为：42℃ 90 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。 　　1.2.5 PCR 取cDNA作为模板扩增FRAT1和GAPDH，其中扩增FRAT1特异性引物为：sense primer：5′-GCCCTGTCTAAAGTGTATTTTCAG-3′，antisense primer：5′-CTCTGCAGTCCTACTCAAGCG-3′。扩增片段长325 bp。扩增GAPDH作为内参对照，引物序列分别是sense primer：5′-TCACCATCTTCCA GGAGCGAG-3′，antisense primer：5′-TGCTCAGTGTAGCCCAGGAT-3′。扩增产物长615 bp。PCR条件为：94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 25 s，72℃ 7 min，4℃ 5 min，30个循环。相关产物在琼脂糖凝胶上电泳鉴定。 　　1.2.6 转染细胞总蛋白的提取及Western blot鉴定 收集细胞后用预冷PBS清洗两遍，加入含PMSF的裂解液（1 ml含1 μl PMSF）200 μl，于冰上裂15 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清。蛋白浓度用BCA法测定，取上清12 μl，与3 μl 5×loading buffer混匀，100℃煮沸5 min，所得样品经SDS-PAGE电泳120 V 25 mA 150 min分离后，冰上电转至PVDF膜50 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，按顺序加入兔抗人FRAT1基因抗体（4℃过夜，次日TBS-T Buffer洗6次，5 min/次），H暗室曝光，显影，定影。底片在UVP凝胶成像系统下成像、保存。 　　1.3 数据分析 　　将PCR及蛋白印迹操作最后得到的胶片进行拍照扫描，用凝胶图像处理系统（Gel-Pro Analyzer）进行分析。分别计算FRAT1各条带与内参GAPDH条带的相对光密度比值。重复3次实验。HT29细胞中FRAT1基因的含量设为1，转 染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体的细胞FRAT1基因下降率求.EMBO J，1997，16（3）：441-450. 　　[2 ] Jonkers J，Weening JJ，van der Valk expression of Frat1 in transgenic mice leads to glomerulosclerosis and nephritic syndrome，and provides direct evidence for the involvement of Frat1 in Res，2004，64（18）：6603-6609.