慢性疲劳综合征的动物造模方法研究概况

【摘要】 归纳 总结 慢性疲劳综合征(cfs)的单因素和多因素动物造模方法以及造模后的行为学观察指标。认为以束缚游泳和悬吊游泳为代表的复合应激造模是目前cfs研究的适用性和可操作性较好的动物造模方法。

【关键词】 慢性疲劳综合征; 模型; 行为学

　　abstract：to summarize the making model method and the ethology index of chronic fatigue syndrome in animals. at present , the optimal making method is bondage in combination with swimming and suspension combination with swimming , which has better applicability and manipulability .

　　key words：chronic fatigue syndrome/cfs; making model; ethology index; review

　　慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，cfs)是美国疾病控制与预防中心(centre for disease control and prevention，cdc)1988年正式命名的、以持续或反复发作不少于6个月严重疲劳为特征，伴有头痛、睡眠障碍，注意力和记忆力下降，抑郁，肌肉骨关节疼痛等多种躯体及精神神经症状[1]。1994年cdc将该标准进行了修订，认为慢性疲劳综合征(cfs)是一组以无力、疲劳、睡眠质量差、认知功能下降及一些躯体症状，如反复咽痒、肌肉痛、头痛、关节痛等为特征的临床综合征[2]，是目前诊断cfs的通用标准。临床上cfs患者的物理和实验室检查通常无特异性表现，cfs的病因及病理机制依然是个谜，因此通过实验的方法制备慢性疲劳动物模型，进行cfs的各种实验观察已经成为cfs研究的重要方法。现笔者对cfs动物实验造模的研究现状作以下综述。

　 　1 慢性疲劳综合征的单因素造模方法

　　cfs单因素造模主要侧重单纯的体力疲劳模型或心理应激模型，它们均能从某一方面模拟人类的疾病状态，如过度训练模型主要从运动能力方面，心理应激模型主要从免疫抑制等方面揭示应激产生的机制，而且单因素造模有较好的操作性和重复性。

　　1.1 强制游泳法 这种造模是目前cfs单因素造模的主要方法之一，具有代表性的是强制冷水游泳法，具体方法是使小鼠每日在不同的时间在水温为(10±1)℃的冷水中游泳，每次游泳持续时间为6～10 min，造模持续时间共9 d[3]。 现代 医学认为，长期的慢性应激是导致或诱发慢性疲劳的重要因素。该方法据此制造了一个包括温度刺激(寒冷)、体力消耗(游泳)以及精神刺激(强制冷水游泳所致情绪刺激)在内的由多种应激因素所致的应激动物模型。它既模拟了中医有关疲劳的发病过程，也符合西医所认为的由慢性应激导致疲劳的理论。但聂晓莉等[4，5]则采用长时间强制游泳，造模方法为实验开始前3 d，每天每只大鼠学习游泳20 min，水温为(24±1)℃ ，随后连续进行5周实验，每天强制游泳2 h。该方法通过长时间游泳，造成躯体疲劳为主而精神疲劳涉及较少的动物模型。

　　1.2 慢性束缚慢性束缚是cfs单因素造模普遍采用的方法，其利用大鼠喜钻洞的特性使动物钻进特制的可调节束缚筒内，并调节到其不产生强烈反抗的紧张程度，平架在木板上3 h，造模持续时间共14 d[6]。慢性束缚应激作为一种非损伤性刺激，与人类心身疾病的过程有相似性。长期反复的束缚主要是通过使动物的躯体活动受限，而使其产生挣扎、急躁、愤怒、抑郁、绝望等心理及行为变化，引起机体的功能紊乱，从而导致躯体及精神疲劳的发生。

　　1.3 跑台训练跑台训练主要是造成躯体疲劳，精神疲劳参与较少，现主要作为运动性疲劳的造模方法，但也可用于cfs的造模，具体方法是每周跑台5 d，前5周训练时速度分别为25，30，33，38，42 m/min，每天跑台20 min，第6周速度为45 m/min跑台25 min，第7周为48 m/min跑台25 min，第8周为48 m/min跑台30 min。所有跑台训练坡度为0[7] 。这种造模有一定的缺陷：并非所有的大鼠都能学会在跑台上跑步，还要采用声、光、电击等手段刺激大鼠跑步，易造成尾部和足部的机械性损伤，引起出血和继发感染，造成个体间差异，影响结果。

　　 2 慢性疲劳综合征的多因素造模方法

　　cfs的病因病机不确定，单一因素很难说明cfs的发生，而多因素致病，多数患者发病与精神心理压力有关的观点受到了多数学者的认可。为了尽可能与临床实际情况相一致，应采用慢性多重复合应激的方法制造cfs模型。

　　2.1 力竭游泳加剥夺睡眠20 h具体方法为每日9：00，大鼠在水深50 cm、水温(25±1)℃的玻璃游泳池负重5%体质量行1次力竭游泳并记录力竭游泳时间(头部沉入水中10 s中不能浮出水面为力竭标准)，后于13：00放入水深1.5 cm塑料盒(有铁丝网盖住，大鼠不能逃脱且可以自由进食饮水)内，给予足够的饮食[8]。研究结果发现睡眠剥夺后大鼠在行为方面表现出抑制性，应激能力下降。还有研究者通过动物实验证实[9]在剥夺大鼠睡眠96 h后，血浆高半胱氨酸水平低于正常组，而且在恢复睡眠24 h或48 h均未恢复正常水平。睡眠不足是产生慢性疲劳的重要原因之一，也是cfs的重要临床症状之一，因此以力竭游泳训练结合部分剥夺睡眠方法创建的慢性疲劳大鼠模型，与人类慢性疲劳的产生原因更加相近，更能够模拟人类慢性疲劳的发生 发展 ，是研究慢性疲劳发生发展机制的重要平台。

　　2.2 束缚跑台法上午束缚，下午进行跑台训练，连续12 d。束缚每3天循序加量1次，时间分别为lh、1.5，2，2.5 h。跑台训练前3天为适应性训练，每天完成10 m/min×10 min的跑台运动，以后为力竭性训练，每天完成10m/min×10 min的运动后，加速至20 m/min×20 min，30 m/min×30 min，40 m/min×40 min，并依次不断递增跑速，直至大鼠力竭[10]。力竭判断标准：连续给大鼠施加声、光、机械刺激后，大鼠不能继续跑动，下跑台后伏地喘息，暂时无逃避反应。该方法是将束缚应激产生的心理或精神疲劳与跑台训练造成的躯体疲劳相结合，模拟人类cfs的发生发展，但采用声、光、电击等手段刺激大鼠跑步，易造成尾部和足部的机械性损伤，易影响实验结果。

　　2.3 悬吊游泳法上午悬吊，下午进行负重游泳，连续12 d。悬吊每3 d循序加量1次，时间分别为1，1.5，2，2.5h。游泳训练前3天适应性游泳30min，以后为力竭性训练，负重3%[10]。力竭标准：①游泳动作明显失调，不能再坚持。② 沉入水下10s不能回到水面。该方法以悬吊作为心理应激，游泳作为躯体应激，造成大鼠的免疫功能紊乱、内分泌失调和营养代谢障碍，与人类cfs发病有相似性，反映了cfs的多重应激机制，而且该方法重复性和可操作性都比较好，不失为多因素造模的有效常用方法。

　　2.4 冷水游泳加束缚应激将游泳和束缚两种方法结合起来，一般采用单日冷水游泳30 min，双日慢性束缚3 h，共21 d，水温为(21±1) ℃[11，12]。而唐纯志等[13]则设定冷水温度为12℃，每天游泳时间为7 min，束缚时间为每天3 min，造模持续时间为1个月。该造模方法考虑了其与cfs患者发病因素的相似性，造模过程中存在温度刺激、体力消耗、一定程度的精神刺激等多种应激因素，从躯体与心理双重角度模拟了cfs的发病，使模型更接近临床发病状态。但造模实验条件的不统一性会使造模方法的可重复性大打折扣，不利于进一步实验的开展。

　　2.5 负重游泳加夹尾刺激按造模动物体重的4%负重(铅皮)放入水深25 cm、水温(21±3)℃的游泳箱中作游泳训练，1次/d，每次以小鼠鼻部没入水中10 s不能抬起为力竭标准，每次训练以力竭为准;并每日予夹尾刺激4次，3 min/次，造模持续时间共6 d[14]。虽然夹尾实验能使老鼠产生挣扎、急躁、愤怒、抑郁、绝望等心理及行为变化，但易造成尾部的机械性损伤，引起出血和继发感染，造成个体间差异，影响结果。

　　此外，还有进食时电刺激结合冷水游泳[15]和肾上腺皮质激素应用-停药法和冷水游泳[16]等造模方法的报道，但应用并不广泛，不具代表性。

　 　3 造模后的行为学观察指标

　　3.1 一般情况主要观察大鼠的精神状态，体重，饮食，活动情况，步态，二便，以及爪、鼻唇、耳等的色泽和眯眼等。 总结 相关 文献 发现，不管采用何种造模方法，均可观察到造模后大鼠出现精神萎靡不振，体重减轻，饮食量和饮水量下降，嗜睡，四肢蜷卧，站立不稳，大便稀，皮肤松弛，体毛干枯无光泽，眯眼次数增加，逃避反应能力下降。

　　3.2 游泳姿势采用游泳作为刺激因素的动物造模后发现，实验前期大鼠蹬水频率快，直线运动较多，漂浮较少，游泳姿势协调。实验中期大鼠蹬水频率明显减少，漂浮较多，游泳姿势不协调，易溺水[4]。

　　3.3 学习记忆情况考察造模后动物的学习记忆情况常用的方法是水迷宫试验，用茶色有机玻璃制成，实验中水深为19cm，水温(28±1)℃ 。造模前1天，训练大鼠学习如何出离迷宫。实验[6]证明模型组出离水迷宫的时间明显低于正常对照组。

　　3.4 探究行为及情绪反应该项行为学指标主要通过旷场实验来恒定，旷场实验[6]是将大鼠放入开阔箱的正中格内，观察大鼠6 min的活动情况。测定指标包括：①正中央格停留时间;②方格间穿行次数(三爪以上跨入邻格的次数);③竖起或修饰次数(两前肢离地lcm以上的次数);④竖起或修饰时间(两前肢离地1 cm以上的时间) 结果模型组大鼠在正中央格停留时间和修饰次数均高于正常对照组，但无显著性差异;而模型组大鼠的穿行次数明显少于正常对照组。

　　3.5 体力情况造模后大鼠的体力情况主要通过鼠尾悬挂实验及力竭游泳实验反映。鼠尾悬挂实验能反映大鼠的体力和情绪，挣扎次数既体现体力情况又反映大鼠渴望改变不适的愿望，静止时间可反映大鼠的绝望情绪。具体方法是将大鼠尾端1 cm的部位贴在一水平木板上(木板离地1 m，)使动物呈倒挂状，两侧用木板隔开动物视线，记录大鼠在6 min内的挣扎次数及其静止时间(大鼠挣扎一定时间后出现的间断性“不动”的“失望”状态的时间)。结果发现模型组大鼠悬尾后6 min内挣扎次数和不动时间均多于正常对照组[17]。力竭游泳实验：记录大鼠从入水至游泳力竭的时间(头部沉入水中10s不能浮出水面为止)。游泳至力竭的时间是反映动物体力及衡量动物是否疲劳的经典指标。实验[6]结果显示模型组大鼠力竭游泳时间明显低于正常对照组。

　　虽然诸多动物实验均采用以上行为学实验作为评价慢性疲劳模型大鼠的躯体和心理疲劳状态的指标，但目前并没有具体的评价cfs动物模型建模成功的统一标准。因此，结合上述一般情况和行为学指标制作出一套评定模型建造成功的量化标准势在必然。

　　 4 讨论

　　综观目前cfs的动物实验研究发现，单因素造模虽然简便易行，重复性相对较好，但只能从体力疲劳或心理疲劳单方面模拟人类疾病状态，却不能很好反映cfs机体的整体性。cfs的病因及发病机制目前尚无确切定论，但与长期精神压力大、体力超负荷等多重应激密切相关。因此，更好的动物模型应结合心理和体力多重应激因素，并且能够在免疫、内分泌和代谢等多个系统出现病理性反应。目前采用的复合应激因素造模主要是将游泳、跑台等运动导致的躯体疲劳和束缚、剥夺睡眠、悬吊、夹尾等刺激造成的精神或心理疲劳相结合模拟人类cfs的发生 发展 ，在一定程度与cfs发病的社会—心理因素相似。其中跑台训练易造成尾部和足部的机械性损伤，引起出血和继发感染，造成个体间差异，影响结果。而且并非所有的大鼠都能学会在跑台上跑步，因此，在运动致疲劳的造模选择中，游泳造模更为可取。悬吊和束缚作为非损伤性刺激更接近于人的心理应激，能较好地模拟人类长期精神刺激所致疾病的病理过程。在体力疲劳应激相同的前提下，悬吊和束缚两种方式从各观察指标来看并无显著性差异[10]。因此，悬吊游泳和束缚游泳两个动物模型用于cfs研究的适用性和可操作性更强。

　　总的来说，cfs动物造模从单因素到多因素，越来越向人类疾病的发生发展靠拢，为研究cfs的机理及评价抗疲劳药物的疗效提供一定的依据。但仍然存在一些不足，如造模方法形式多样，缺乏规范统一性;而具体到同一种造模方法，其实验条件也大相径庭;至于实验动物的选择也是缺乏一致性，如多数研究者采用的是大鼠和小鼠，也有少数用兔和猫;而最为重要的造模成功的标准也未见明确。这些问题都有待进一步的实验研究来解决。

【 参考 文献】
　　[1] holmes gp，kaplan je，gantz nm，et c fatigue syndrome：a working case definition [j].ann intern med，1988，108(3)：387.

　　[2] fukuda k，strans se，hickie i,et international chronic fatigue syndrome study chronic fatigue syndrome：acomprehensive approach to its definition and study [j].ann intern med，1994，121：953.

　　[3] 石世德,周民伟,李建军,等.安可梦口服液对慢性疲劳模型动物行为和神经内分泌影响的实验研究[j].浙江中医学院学报,2004,28(6):47.

　　[4] 聂晓莉,李晓勇,靳 文,等.慢性疲劳大鼠模型的建立及其对肝功能的影响[j].热带医学杂志,2007,7(4):323,344.

　　[5] 聂晓莉,李晓勇,靳 文,等.慢性疲劳对大鼠肝脏功能的影响[j].广东医学,2008,29(1):42.

　　[6] 王天芳,陈易新,季绍良,等.慢性束缚致慢性疲劳动物模型的研制及其行为学观察[j].