P450 1A1基因IleVal多态性与子宫颈癌的相关性研究

摘　要：目的：研究P450 1A1基因IleVal位点多态性与子宫内膜癌发生的关系。方法：用PCR-RFLP法检测32例子宫颈癌患者和114例对照者P450 1A1基因IleVal位点多态性。结果：对照组和观察组的CYPlAl基因IleVal多态野生型、杂合型和突变型基因型频率分别为42.5%、39.2%、8.2%和30.2%、44.5%、15.2%，观察组杂合型和突变型基因型频率明显高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。合并杂合型和突变型与野生型相比，观察组和对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：P450 1A1基因IleVal多态中突变等位基因可显著增加子宫内膜癌的发病风险，同时表达不同反映了不同类型的子宫颈癌组织雌激素调节水平不同，可能为子宫内膜异位症的发病机制找到了理论依据。

关键词：子宫颈癌；P450 1A1基因；IleVal多态性；PCR-RFLP
　　子宫颈癌发病率高，病因和发病机理仍不十分明确。对子宫颈癌的家族及环境影响因素的研究表明子宫颈癌是由遗传基因的易感性和环境影响共同作用而形成的，子宫颈癌有一定的遗传基础和家族聚集倾向。最近，研究表明子宫颈癌患者异位内膜组织不只有P₄₅₀ 1A1基因的表达，而且子宫颈癌患者血浆及腹腔液中的P₄₅₀ 1A1水平也比正常非子宫颈癌妇女有明显提高[1]。当某一特定的基因突变或缺失被固定在某一人群中并呈现高发时，这一基因就被称为具有多态性[2]。正常人群对某一类药物的代谢一般表现为强代谢。弱代谢者则与特定药物在体内不能代谢而造成堆积有关，往往是由常染色体的隐性遗传引起的，主要是两个等位基因的突变和（或）缺失引起表型的改变[3]。对于某些治疗药物或环境及职业致癌物，药物代谢酶的遗传多态性在治疗药物的不良反应和与接触相关的的癌症发生率方面扮演着非常重要的角色。因此，测定这些基因的遗传多态性在预测对某一治疗药物的不良反应或疗效，以及预测环境或职业相关疾病的发病危险性方面是有非常可行的临床意义。本试验为此通过PCR方法研究了P₄₅₀ 1A1基因IleVal多态性与子宫颈癌的相关性。
1 资料与方法
1.1  一般资料：随机选择自2008年10月～2010年2月在我院经开腹或腹腔镜手术切除的，并经大体及病理检查确诊为Ⅳ期卵巢子宫颈癌32例（据AFS修订的子宫颈癌分期法进行评分，均＞40分）为观察组，年龄26～45岁，平均36.5岁。对照组：选择同期有正常生育史，在我院行输卵管复通术或浆膜下子宫肌瘤剔除术的患者32例，术中排除子宫颈癌。两组术前均经超声检查排除乳腺癌及其他妇科疾病，排除家族性遗传病如糖尿病、高血压等。两组年龄、疾病发生等方面比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
1.2  PCR检验
1.2.1 组织总RNA提取：分别取两组离体癌组织、正常组织各约100 mg在液氮环境下，捣碎并研磨成粉，迅速置于1.5 ml eppendof管中，加1 ml Trizol RNA提取液，4℃离心12 000 r/min×15 min，吸取上清到另一eppendof管中，加入O.5 ml异丙醇混匀，冰浴沉淀lO min，离心12 000 r/min×10 min，弃上清，沉淀加75%乙醇1 ml洗涤1次，沉淀溶于O.1% DEPC水中，待用。
1.2.2 cDNA的合成：取RNA 1 μg，用SUPER SCRIPTI逆转录试剂盒l进行逆转录，所得cDNA用于PCR扩增。①引物设计：P450 1A1引物（理论扩增片段为182 bp）。上游引物：5’＞ATTGAATGAAAACATCAGGATTG＜3’；下游引物：5’＞GAG GGT TGT TGATGT CCATC＜3’。内参照βactin引物（理论扩增片段为250bp）。上游引物：5’＞TTC CAG CCTTCCTTC CTGGG＜3’；下游引物：5’＞TTG CGC TCAGGAGGAGCAAT＜3’。②半定量检测：取20 μl PCR产物经1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，然后应用相关软件进行定量分析。
1.3  统计学方法：本文所有数据用SPSS 13.5软件进行统计分析。两组之间等位基因及基因型频率比较用用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
　　对照组中的CYPlAl基因IleVal多态位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。对照组和观察组的CYPlAl基因IleVal多态野生型、杂合型和突变型基因型频率分别为42.5%、39.2%、8.2%和30.2%、44.5%、15.2%，观察组杂合型和突变型基因型频率明显高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。合并杂合型和突变型与野生型相比，观察组和对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图1。

图1  CYPlAl基因IleVal多态位点的基因型分布PCR
注：M：marker；1、3：突变型；2、6：野生型；4、5：杂合型；7：βactin
3 讨论
　　宫颈癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一，其发生机制至今尚不清楚。HPV特别是HPV 16、18等高危型别感染是引起宫颈癌变的首要因素。但HPV感染并非诱发宫颈癌的唯一因素，尚需与其他因素协同作用，才能导致宫颈恶性病变的发生[4]。临床资料提示，HPV感染与雌激素及其受体在宫颈病变的发生发展中可能存在某些协同作用[5]。
　　细胞色素P₄₅₀芳香化酶是细胞色素P₄₅₀的一种，是细胞色素P₄₅₀产物中唯一有单基因编码的酶，是雌激素合成过程中的最后一步限速酶，主要作用是将雄烯二酮和睾酮转化为雌酮和雌二醇。调节芳香化酶表达的启动因子具有组织特异性，正常子宫内膜存在抑制转录因子，连接到P₄₅₀的启动基因，使子宫内膜无该酶的表达。肿瘤上皮细胞可通过自分泌芳香化酶合成雌激素，其周围的间质细胞通过增加合成或释放生长因子以旁分泌方式产生雌激素，促进肿瘤的生长。P₄₅₀ 1A1基因定位于第15号染色体，有7个外显子。目前，发现P₄₅₀ 1A1基因有4个多态性位点。这些多态性在不同人群的分布表现出较大的差异，如IleVal多态突变型C/C基因型频率中国人为25%，而拉丁美洲人为95%[6]。已有研究表明，芳香酶表达的调控主要是在转录水平，由启动因子调节的[7]。多种启动因子在芳香酶在位和异位子宫内膜中的表达、转录起着决定性的作用。某些染色体基因的关键区、某些抑癌基因可以抑制子宫颈癌患者在位及异位的子宫内膜中芳香酶启动因子的活性[8]。
　　本研究发现，P₄₅₀ 1A1基因在子宫颈癌患者在位子宫内膜腺细胞胞质中强表达，在正常内膜中弱表达或不表达，与国外研究的研究结果一致，提示芳P₄₅₀ 1A1基因可能对正常子宫内膜的生理功能影响不大，而P₄₅₀ 1A1基因的阳性表达与促进子宫内膜局部雌激素的转化作用有关，可能是导致子宫内膜异症发生的因素。在IleVal多态性与子宫颈癌的相关性方面，本研究结果显示P₄₅₀ 1A1基因密码子119、432多态位点的基因型分布 和等位基因频率在子宫内膜癌患者和对照组之间均有显著性差异。突变等位基因T、G使患子宫内膜癌的相对危险度分别增加；突变基因型与野生型相比，患子宫内膜癌的危险度也分别增加。因此表明P₄₅₀ 1A1密码子IleVal多态性与子宫内膜癌的易感性相关。突变基因型可能增加内源性或外源性雌激素作用、增加机体对雌激素作用的敏感性、，在子宫内膜癌发生、发展中起着至关重要的作用。
　　总之，子宫颈癌患者在位、异位内膜腺细胞P₄₅₀ 1A1基因表达增加，可促进异位病灶的生长，表达不同反映了不同类型的子宫颈癌组织雌激素调节水平不同，可能为子宫内膜异位症的发病机制找到了理论依据。但是P₄₅₀ 1A1基因与宫颈癌关系的研究是一项崭新的课题，具有广阔的研究领域及应用前景，二者之间关系仍有待于深入的研究。
4 参考文献
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