巢式聚合酶链反应对白血病融合基因的检测分析

摘　要：目的：探讨并分析巢式聚合酶链反应在白血病融合基因中的检测与应用。方法：回顾性分析71例白血病患者的临床资料，运用巢式聚合酶链反应，检测患者包括bcr/abl、PML/RARa、AML/ETO所有融合基因融和变异的引物阳性率。结果：38例慢性粒细胞白血病患者，bcr/abl融合基因的总阳性率为83.4%。12例急性早幼粒细胞白血病患者，PML/RARa融合基因的总阳性率为57.1%。6例急性粒细胞白血病M2患者，AML/ETO总阳性率为27.9%。结论：巢式聚合酶链反应具有较高准确性、灵敏性、简便性，为临床治疗提供较高的参考价值。

关键词：巢式聚合酶链反应；白血病融合基因；检测分析
    白血病患者经治疗完全缓解后体内仍残留少量白血病的状态，即微小残留白血病（MRD），此时须计算残留白血病细胞的多少对患者作进一步治疗方案。如临床医生不计算仅凭经验治疗，又不计算治疗后残留病灶多少将导致MRD高的患者治疗强度不够，而MRD低或无的患者因过度治疗而出现严重的毒副反应^[1-3]。结合高敏感巢式聚合酶链反应，检测71例白血病患者的融合基因阳性率，探讨巢式聚合酶链反应在白血病融合基因检测，及白血病诊断、治疗、预后的临床应用价值，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1  一般资料：选取我院自2009年1月～2011年6月收治的71例白血病患者的临床资料。男45例，女26例，年龄15～71岁，平均（41.2±2.8）岁；患者中慢性粒细胞白血病38例，急性淋巴细胞白血病15例，急性早幼粒细胞白血病12例，急性粒细胞白血病6例。

1.2  纳入及诊断标准：根据张之南著《血液病诊断及疗效标准》，科学出版社2007年版；白血病细胞形态学诊断标准按1986年全国白血病细胞遗传学讨论会制定的白血病诊断标准。

1.3  检测方法：细胞形态学检查。患者骨髓涂片，行组化染色分析，采用1986年的标准进行诊断。

    巢式RT-PCR检测。提取患者3～5 ml骨髓，使用淋巴分享液分离单个核细胞，PBS溶液洗涤后分离，用Trizo试剂溶解细胞，异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取骨髓细胞及对照细胞RNA，使用紫外分光光度仪测RNA浓度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检查RNA的降解情况。

    引物选择按文献序列合成两对巢式引物，其序列如下：A：5’-GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC-3’；B：5’-TCAGACCCTGAGGCTCAAAGTC-3’；C：5’-GCAGCAGAAGAAGTGTTTCAG-3’；D：5’-GTGATTATAGCCTAAGACCCC-3’。

    第一步引物C+D：b₃a₂ 400 bp；b₂a₂ 325 bp；第二步引物A+B：b₃a₂ 200 bp；b₂a₂ 125 bp，以上用作预留PCR产物。

    第一步：PCR扩增。在20 μl反应体系中，含有逆转录反应物5 μl及PCR反应缓冲液，取1 μl及PCR反应缓冲液，dNTP、引物C、D，Taq DNA聚合酶，94℃变性50 s，55℃退火50 s，进行30个循环；第二步：PCR扩增。20 μl反应体系，取第一步预留的PCR产物1 μl，加入引物A与B，PCR反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶，与上步PCR条件30循环；第三步：PCR产物检测。取第二步PCR产物，使用含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳，观察并拍照。

    在每个反应试管中，做1个阳性对照和2个阴性对照，2个阴性对照一个为无RNA的空白对照，另一个为正常RNA阴性对照。

2 结果

    经检测对照发现，38例慢性粒细胞白血病患者，bcr/abl融合基因的总阳性率为83.4%。12例急性早幼粒细胞白血病患者，PML/RARa融合基因的总阳性率为57.1%。6例急性粒细胞白血病M₂患者，AML/ETO总阳性率为27.9%。详见表1。

表1  白血病患者cr/abl融合基因的阳性率检查[例（%）]

3 讨论

    MRD是白血病复发的主要诱因。巢式聚合酶链反应是一种具有较高准确性、灵敏性、操作简便易行的检测白血病患者治疗后微小残留病的检测方式，其敏感性可达1/10⁶，是监测MDR的有效方法之一。同时选择适合的检测靶标，有助于监测MRD的关键，通过平衡易位形成融合基因成为常见治疗措施。

    在研究中，融合基因的结构、功能各不相同，应注意同一融合基因表现为断裂位点不同的亚型，在设计检测引物时给予覆盖。准确全面地引物设计是监测MRD的重要条件。本组研究设计合成涵盖bcr/abl、PML/RARa、AML/ETO所有融合基因融和变异的引物，具有较高的准确性，与FISH结果相比，符合率高达95%以上，是灵敏、准确、高效的MDR指标，为临床治疗提供较高的参考价值。

4 参考文献

[1] 郑维扬,周淑芸,王小琪,等.筑巢式PCR检测白血病微量残留bcr/abl mRNA[J].中华血液学杂志,1994,12(1):99.

[2] 孙  良,何庆梅,刘  鲲,等.巢式聚合酶链反应对231例白血病融合基因的检测[J].实用药学杂志,2011,27(5):776.