针刺调节MAPK/ERK通路对脑缺血模型大鼠的干预作用

作者：杨忠华,许能贵,易玮,于涛,董正妮

【摘要】 【目的】 观察电针调节丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mapk/erk)通路对脑缺血模型大鼠的干预作用。 【方法】 选用sd大鼠,随机分为假手术组、模型组和电针组,每组又分为2 h、1 d、3 d 3个亚组,后2组采用热凝闭大脑中动脉法复制局灶性脑缺血模型。电针组针刺百会、大椎穴,每天1次,分别治疗2 h、1 d、3 d。每组均进行神经行为学评分及y迷宫测试,并采用免疫组化法检测脑组织ca1区、ca3区磷酸化epk(pepk)阳性细胞表达的积分光密度值总和(dsum)。 【结果】模型组大鼠神经行为学评分显著升高、y迷宫测试时间显著延长(均p<001),电针1 d、3 d组可显著降低神经行为学评分,缩短y迷宫测试时间,与模型组及电针2 h组比较差异均有显著性意义(p<005或p<001)。假手术组无pepk阳性细胞表达,模型组ca1区和ca3区dsum 显著升高(均p<001),电针各组ca1区、ca3区dsum均较模型组显著降低(p<005或p<001),而电针1 d、3 d组dsum降低幅度显著大于电针2 h组(均p<005)。 【结论】 电针可以通过调节mapk/erk通路,降低perk在脑缺血早期的表达,从而改善脑缺血模型大鼠的脑组织损伤。

【关键词】 脑缺血/针灸疗法;脑/病理学;疾病模型,动物;大鼠;穴,百会;穴,大椎

细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,erk)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,mapk)的一种,是非常保守的信号系统,它们存在于从酵母到哺乳动物的各种细胞中[1]。erk调节着细胞的增殖、分化和存活,一方面可通过接受大量来自生长因子、丝裂原、环境刺激等的信号,另一方面通过erk信号级联反应作用于核转录因子,调控基因表达[2-4]。目前,已开始寻找针对erk途径中各个环节的调控机制,用以调控信号转导的途径,而erk传导通路在局灶性脑缺血后被激活,并在缺血性组织损伤中发挥重要作用,针对erk的变化规律进行有效干预可望为急性缺血性脑卒中提供一个新的路径。本研究观察了针刺调节mapk/erk通路对脑缺血模型大鼠的影响,现报道如下。

　　1材料与方法

　　11动物spf级雄性spraguedawley大鼠90只,体质量180～240 g,用抽签法随机分为假手术组、模型组和电针组,每组又分为2 h、1 d、3 d 3个时间段组,共9个亚组,每亚组各10只。手术后模型1 d组死亡2只,模型3 d组死亡1只,针刺2 h组死亡1只,死亡鼠均予剔除。

　　12主要仪器及试剂1寸毫针,直径03 mm×25 mm，由苏州医疗用品厂生产,华佗牌电子针疗仪由苏州医疗用品厂有限公司提供,y迷宫由上海仕元科学器械有限公司提供,932型电热凝器由上海医疗器械八厂生产。磷酸化p44/42map kinase一抗由武汉博士德公司提供,免疫组化染色试剂盒(即用型sabc)由武汉博士德公司提供。

　　13模型复制采用热凝闭大脑中动脉法复制局灶性脑缺血模型[5]。假手术组只暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭。治疗组造模后立即给予电针治疗。

　　14治疗方法治疗组选取督脉经穴百会、大椎两穴[6],以毫针斜刺百会03寸,直刺大椎03寸,用疏密波,5～10次/s,强度以大鼠安静耐受为度,约3～5 v,时间30 min,每天1次。分别连续治疗2 h、1 d和3 d。

　　15动物神经运动功能体征的观察采用bederson评分标准。假手术组、模型组和电针组3组大鼠于造模后2 h、1 d和3 d不同时间段每组随机抽取8只大鼠分别进行神经功能行为评分。

　　2010年第27卷广州中医药大学学报杨忠华，等.针刺调节mapk/erk通路对脑缺血模型大鼠的干预作用第1期16y迷宫实验y型电迷宫3条臂的尽头均有1灯,底部是电网,其中只有1条臂尽头的灯发出亮光,此时该臂底部电网无电流通过,即为安全区。另两臂的灯不亮,底部电网通电(约50 v),为非安全区。安全区与非安全区随机改变。实验开始时,将动物放入迷宫中任一臂中适应2～3 min。然后将其他任一臂的信号灯打开作为条件刺激,经1 s延迟后,灯不亮的两臂通电(非条件刺激)。当动物逃避电击至安全区后,灯亮持续15 s,然后熄灯休息45 s,即完成1次操作并记录所用时间。然后再开始下一次操作。

　　161筛选将大鼠放入y迷宫箱中适应3～5 min,给予适当电击,至其对3臂均探索进入为止,选择活跃,对电击反应较敏感的大鼠入组,淘汰反应过于迟钝或敏感的大鼠。

　　162学习测试对筛选后的大鼠,采用固定次数随机法[7],每天给予20次迷宫训练。安全区以无规则次序变换,大鼠受电击逃到安全区后,灯光继续作用10～15 s,熄灯后结束1次测试,大鼠所在支臂作为下一次测试的起点。每只大鼠每天固定训练20次,连续训练4 d。以大鼠受信号刺激后跑向红灯安全区,在安全区躲避30 s以上,不再跑回其他2臂为正确反应。

　　163学会标准以连续20次测试中的错误反应次数(error number,en)≤2次作为学会标准。从筛选后学习测试达标的各组大鼠中随机取5只,分别于手术后2 h、1 d和3 d进行试验,观察各组大鼠受到电刺激后从非安全区跑至安全区所用时间作为在y型迷宫的测试成绩。

　　17磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(perk1/2)表达检测上述各组动物进行实验后在规定时间内腹腔内注射100 mg/l水合氯醛(40 mg/kg)麻醉动物。开胸后剪开右心耳,从左心室插管至主动脉,先用150 ml生理盐水(室温)快速灌注,随后用含40 g/l多聚甲醛的01 mol/l磷酸钠盐缓冲液500 ml(4℃)灌注固定2 h。将脑取出后放入含300 g/l蔗糖的01 mol/l磷酸钠盐缓冲液中,并置于4℃冰箱内直到沉底。冠状冰冻切片,厚度20 μm。perk的免疫组织化学染色均严格按说明书操作。采用ipp 60图像分析系统检测,测定ca1区、ca3区(10×20倍)视野中perk阳性细胞区域的积分光密度值总和(dsum),以评估perk的含量变化。

　　18统计学方法多组间比较采用单因素方差分析(oneway anova),各组间两两比较采用q检验(newmankeul法),所有统计均采用spss 130统计软件进行分析。

　　2结果

　　21各组大鼠脑缺血区不同时段神经功能行为评分表1结果显示：模型组大鼠神经行为学评分显著升高(p<001)。电针1 d、3 d组大鼠神经行为学评分显著降低,与模型组及电针2 h组比较差异均有显著性意义(p<005或p<001)。表1各组大鼠脑缺血区不同时段神经功能　行为评分比较

　　22各组大鼠不同时段y迷宫测试成绩表2结果显示：模型组大鼠y迷宫测试时间显著延长(p<001)。电针1 d、3 d组可显著缩短大鼠y迷宫测试时间,与模型组及电针2 h组比较差异均有显著性意义(p<005或p<001)。

　　23各组大鼠不同时段ca1区和ca3区perk积分光密度值总和比较表3、表4结果显示假手表2各组大鼠不同时间段y迷宫测试成绩比较

　　术组无perk1/2阳性细胞表达。模型组ca1区和ca3区dsum显著升高(均p<001),在2 h时最高,之后逐渐降低。电针各组ca1区和ca3区dsum均较模型组显著降低(p<005或p<001),而电针1 d、3 d组dsum降低幅度显著大于电针2 h组(均p<005)。表3各组大鼠ca3区perk1/2 表达比较表4各组ca1区perk1/2表达比较

　　24各组大鼠不同时段ca1区和ca3区perk表达比较图1～图6(彩图见第99~100页)显示：模型组与电针组perk1/2在2 h至3 d均有阳性表达,2 h时可见棕黄染色的细胞密集,主要见于胞浆,只有少许胞核染色。多数阳性细胞带有树样突起,随着时间延长,胞核呈阳性染色者越来越多。至损伤1 d后电针组则以胞核阳性染色细胞为主,胞浆染色阳性者减少,染色变淡。

　　3讨论

　　缺血时,组织低氧可使细胞内外环境发生重大变化,细胞反应可表现为坏死或凋亡,同时细胞也启动了修复机制对缺氧损伤进行自我修复。目前的研究发现mapk信号转导途径的各个成员在组织细胞缺血时均会发生相应的变化,可能参与了细胞的损伤或修复的调控。脑缺血发生后,可通过各种胞膜受体介导,激活蛋白激酶c(pkc)途径、腺苷酸环化酶(ac)途径、肌醇三磷酸激酶(pi32k)途径和酪氨酸受体途径等已知途径,再激活mapk级联反应[8]。研究发现,不论是短暂性还是永久性缺血损伤,mapk均发挥重要的作用。在大脑中动脉永久栓塞(mcao)模型中,erk1/2在缺血后的不同时间活性显著升高,证实脑缺血可快速触发mapk磷酸化,提示mapk参与了脑缺血早期病理生理机制的信号传递。缺血的中心区和半暗带的信号转导通路可能不同,在中心区磷酸化的应激活化蛋白激酶(sapk/jnk)显著增多,而在半暗带区mapk/erk、sapk/jnk、p38活性均明显升高,提示可能有不同的信号因子参与半暗带的信号转导[9]。炎性反应因子参与了脑缺血后神经元的损伤,mapk途径抑制剂也可通过抑制各种炎性因子而起到保护神经元的作用[10]。

　　本研究通过神经功能行为评分及y迷宫实验的观察说明本次实验造模是成功的,且提示电针对脑缺血大鼠的神经缺损症状有明显改善作用,而且还发现脑缺血后2 h,ca1区和ca3区perk的表达显著升高,而1 d和3 d的表达则逐渐降低。电针干预后,电针各组指标均比模型组降低,说明perk的高表达可能只限于缺血缺氧的早期,之后1～3 d就逐渐回落。电针可以调控mapk/erk信号通路,降低perk的表达,干预脑缺血早期mapk/erk信号通路对神经元可能产生的毒性作用,减轻脑组织损伤,对大脑起到保护作用。本研究定位于脑缺血早期的研究,对于mapk/erk信号通路在整个脑缺血过程中的作用还有待于进一步研究。目前有关mapk/erk通路对于脑缺血的作用仍意见不一,有学者认为其对脑缺血神经元有保护作用[11],也有人认为其对脑缺血神经元有损伤作用[12],还有人认为在不同时段、不同区域mapk/erk通路表达的作用不同,更有认为erk可能是一把双刃剑[13],既能抑制凋亡,也可引起坏死,erk通路激活对神经元坏死可能是必要的,也可能erk通路是其他细胞死亡通路激活的闸门之一。因此还需对mapk级联反应在缺血性脑损伤中的作用做更深入和全面的动态研究,明确其作用的具体分子机制、具体靶基因和蛋白,以便为临床缺血性脑损伤的治疗提供新思路。

【参考文献】
　[1]widmann c,gibson s,japrpe m b,et almitogenactivated protein kinase:conservation of a threekinase module from yeast to human[j].physiol rev,1999,79∶143.

　　[2]nichols a,camps m,gillieron c,et alsubstrate recognition domains within extracellular signalregulated kinase mediate binding and catalytic activation of mitogenactivated protein kinase phosphatase3[j].j biol chem, 2000,275(32)：24613.

　　[3]bokemeyer d,sorokin a,dunn m jmultiple intracellular map kinase signaling cascades[j].kidney int,1996,49(5)：1187.

　　[4]davis r jthe mitogenactivated protein kinase signal transduction pathway[j].j biol chem,1993,268(20)：14553.

　　[5]许能贵,易玮,马勤耘,等电针对大鼠局灶性脑缺血后神经元损伤保护作用的研究[j].中国针灸,2000,20(4)：237.

　　[6]华兴邦,李辞蓉,周浩良,等 大鼠穴位图谱的研制[j]. 实验动物与动物实验,1991(1)：1.

　　[7]王跃春大鼠y型迷宫测试法的筛选与优化[j].中国行为医学,2005,14∶50.

　　[8]borsello t, clarke p g, hirt l, et al a peptide inhibitor of cjun nterminal kinase protects against excitotoxicity and cerebral ischemia[j]. nat med, 2003, 9(9) : 1180.

　　[9]ferrer i,friguls b,dalfo e,et alearly modifications in the expression of mitogenactivated protein kinase(mapk/erk),stressactivated kinases sapk/jnk and p38,and their phosphorylated substrates following focal cerebral ischemia[j].acta neuropathol (berl),2003,105(5):425.

　　[10]piao c s,kim j b,han p l,et aladministration of the p38 mapk inhibitor sb203580 affords brain protection with a wide therapeutic window against focal ischemic insult[j].j neurosci res,2003,73(4):537.

　　[11]schrader l a,bimbaum s g,nadin b m,et alerk/mapk regulates the kv42potassium channel by direct phosphorylation of the poreforming subunit[j].am j physiol cell physiol,2006,290(3)：852.

　　[12]alessandrini a,namura s,moskowitz m a,et a1mekl protein kinase inhibition protects against damage resulting from focal cerebral ischemia[j].proc natl acad sci usa,1999,96(22)：12866.

　　[13]李军,曹红mapk级联反应与缺血性脑损伤[j].国外医学：麻醉学与复苏分册,2002,23(4)：232.