安宫牛黄丸对脓毒症大鼠肺组织高迁移率族蛋白

作者：张丹,胡质毅,黄萍,李俊,王艳丽

【摘要】 【目的】观察安宫牛黄丸对盲肠结扎穿孔术致脓毒症模型大鼠肺组织高迁移率族蛋白b1(hmgb1)mrna表达及髓过氧化物酶(mpo)活性的影响。【方法】75只雄性sd大鼠随机分为正常对照组,脓毒症模型组(clp组),1α氰基(3,4羟基)n苄苯乙烯胺组[ag490组,术前05 h皮下注射8 mg/kg的janusk激酶2(jak2)抑制剂ag490],雷帕霉素(rpm)组[rpm组,术前05 h皮下注射04 mg/kg的信号转导和转录激活子(stat)抑制剂rpm],安宫牛黄丸低、中、高剂量组(术前05 h和术后6 h按10、20、30 g/kg剂量灌胃)。于造模后24 h活杀动物,留取肺组织,采用逆转录—聚合酶链反应(rtpcr)法检测肺组织hmgb1 mrna表达水平,同时测定mpo活性。【结果】与正常对照组比较,clp组肺组织hmgb1 mrna表达显著增强(p<001),mpo活性显著增高(p<005)。与clp组比较,ag490组、rpm组以及安宫牛黄丸低、中、高剂量组hmgb1 mrna表达显著下调(p<001),ag490组、rpm组以及安宫牛黄丸低、中剂量组mpo活性显著降低(p<005或p<001)。【结论】安宫牛黄丸治疗脓毒症的作用与ag490、rpm等jak/stat信号通路抑制剂相似,可下调肺组织hmgb1基因表达,降低肺组织mpo活性,减轻腹腔感染所致的急性肺损伤。

【关键词】 安宫牛黄丸/药理学;脓毒症/中药疗法;基因表达调控;疾病模型,动物;大鼠

高迁移率族蛋白b1(hmgb1)是严重感染所致脓毒症的重要晚期介质,参与了包括肺脏、肝脏、肠道在内的多器官损害过程[1-2]。肺组织髓过氧化物酶(mpo)活性可定量反映肺组织中性粒细胞(pmn)扣押与聚集的数目,在一定程度上反映肺组织的炎症损伤程度[3-4]。本研究旨在观察盲肠结扎穿孔致脓毒症大鼠肺组织hmgb1 mrna表达的变化规律，及安宫牛黄丸对肺组织hmgb1 mrna表达和炎症损伤指标mpo活性的干预作用并探讨其可能作用机理,为寻找中医药干预脓毒症的有效途径提供依据。现报道如下。

　　1材料与方法

　　11主要药物、试剂与仪器安宫牛黄丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产(批号：5010279),水合氯醛由国药集团化学试剂有限公司生产(批号：20071210),mpo活性检测试剂盒由南京建成科技有限公司提供(批号：071103),1α氰基(3,4羟基)n苄苯乙烯胺(ag490)为美国alexis biochemicals产品,雷帕霉素(rpm)为美国alexis biochemicals产品,总rna提取试剂盒为日本takara公司产品，逆转录—聚合酶链反应(rtpcr)试剂盒为立陶宛fermentas (mbi)公司产品，wfj 7200型可见光分光光度计为尤尼柯(上海)仪器有限公司产品。

　　12动物模型制备健康雄性sd大鼠75只,体质量180～220 g,购自广东省医学实验动物中心,合格证号：0031637。在wichterman[5]报道的方法的基础上进行改良,复制腹腔感染型脓毒血症。术前禁食12 h,用100 mg/l水合氯醛按15 ml/kg的剂量腹腔注射麻醉大鼠,常规消毒腹部,在下腹部正中央切口,长约2 cm,打开腹腔寻找盲肠,小心分离其远端与大肠的系膜,寻找盲肠与小肠及大肠交界处,用灭菌4号丝线环形结扎。在与肠系膜相对的盲端肠壁浆膜面用9号针头穿刺2次,2个针孔相距约3 mm,第1针孔距盲端约3 mm,同时在第2针孔处放置1条宽2 mm的橡胶引流片,防止伤口愈合,轻轻将肠管放回原处,关闭腹腔,逐层缝合。术后即刻皮下注射生理盐水,补充手术过程中体液的丢失,剂量10 ml/kg。

　　2010年第27卷广州中医药大学学报张丹，等.安宫牛黄丸对脓毒症大鼠肺组织高迁移率族蛋白b1基因表达及髓过氧化物酶活性的影响第1期13动物分组与给药75只大鼠随机分为正常对照组，脓毒症模型(clp)组,ag490组，rpm组，安宫牛黄丸低、中、高剂量组。ag490组于术前05 h皮下注射8 mg/kg 的janusk激酶2(jak2)抑制剂——ag490,rmp组于术前05 h皮下注射04 mg/kg的信号转导和转录激活子(stat)抑制剂——雷帕霉素,安宫牛黄丸低、中、高剂量组分别于术前05 h和术后6 h按10、20、30 g/kg剂量灌胃安宫牛黄丸,正常对照组、clp组、ag490组和rpm组动物灌胃等容积蒸馏水。

　　14标本采集和处理于造模后24 h活杀动物,无菌条件下取肺组织50 mg置于液氮中保存。无菌状态下,另取肺组织200 mg,加入18 ml生理盐水在冰浴下匀浆,3 000 r/min离心15 min,取上清液。

　　15检测指标和方法

　　151采用rtpcr法检测肺组织hmgb1 mrna表达水平称取肺组织约50 mg,以异硫氰酸胍一步法提取细胞总rna,扩增转录产物,以三磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)作为内参对照。大鼠hmgb1序列(扩增片段为680 bp)[2]：5′atgggcaaaggagatccta3′(上游);5′attcatcatcatcttct3′(下游)。gapdh序列(扩增片段为309 bp)[6]：5′tccctcaagattgtcagcaa3′(上游);5′agatccacaacggatacatt3′(下游)。扩增产物经20 g/l琼脂糖凝胶电泳后照相,底片采用uvps gds 7600图像分析系统处理,通过目的基因与内参对照的吸光度比值(p)表示mrna相对表达量。

　　152肺组织mpo活性检测取已制备成的肺组织匀浆,按髓过氧化物酶检测试剂盒说明进行操作,于可见光分光光度计上读取d值,通过公式计算mpo活性单位数值：jmpo=(d测定管-d对照管)×113×m取样。

　　16统计学方法应用spss 115统计软件包进行统计分析,采用t检验和方差分析。

　　2结果

　　各组对脓毒症大鼠肺组织hmgb1 mrna表达及mpo活性的影响见表1、图1。与正常对照组比较,clp组大鼠肺组织hmgb1 mrna表达显著增强(p<001),而mpo活性显著增高(p<005)。与clp组比较,rpm组、ag490组以及安宫牛黄丸低、中、高剂量组hmgb1 mrna表达均显著下调(p<001),而rpm组、ag490组以及安宫牛黄丸低、中剂量组mpo活性显著降低(p<005或p<001)。尽管安宫牛黄丸高剂量组与clp组比较有降低的趋势,但差异无显著性意义(p>005)。表1各组对脓毒症大鼠肺组织hmgb1 mrna表达及mpo活性的影响

　3讨论

　　hmgb1是一种胞内广泛存在的高度保守的dna结合蛋白,具有稳定核酸结构、调节转录和基因表达等多种功能。近年研究[7]显示它还具备多种细胞外效应,例如细胞释放hmgb1至胞外发挥促进细胞分化、触发及调节炎症等作用。hmgb1对机体的作用具有剂量、效应依赖性,即中等浓度的hmgb1对宿主反应是有益的,能够限制炎症或组织损伤进展,促进损伤修复和组织再生[8];而高浓度的hmgb1则导致炎症反应失控,促使原有损伤进一步恶化甚至出现广泛组织损害和器官衰竭[7]。新近研究表明,hmgb1是严重感染所致多脏器功能障碍综合征(mods)的重要晚期介质,其参与了包括肺脏、肝脏、肠道在内的多器官损害过程,胞外hmgb1失控性释放的病理学效应与严重感染或创伤打击诱发全身性促炎因子反应引起机体实质细胞功能障碍密切相关[9]。jak/stat通路可能部分参与hmgb1合成、释放的信号调控过程[10]。动物整体实验也证实,抑制jak/stat途径可显著下调多种组织hmgb1基因的表达,表明jak2、stat1及stat3的确参与了hmgb1诱生过程[11]。

　　mpo是中性粒细胞(pmn)特有的还原酶,它主要存在于pmn的嗜天青颗粒中,且每个细胞所含酶的量是恒定的,约占细胞干质量的5%,故可以通过检测组织mpo活性来定量测定pmn的数目,肺组织中mpo活性可定量反映pmn扣押与聚集的程度[3-4]。流经肺毛细血管活化的pmn易与内皮细胞接触并粘附、聚集于肺脏。而肺组织活化pmn经脱颗粒作用,释放弹性蛋白酶、髓过氧化物酶和金属酶等多种蛋白酶,分解胞外纤维与基质,可导致肺组织损伤[12]。

　　本实验结果显示,clp术后24 h 脓毒症模型大鼠肺组织hmgb1 mrna表达明显增强,显著高于正常对照组。与此同时,clp术后反映中性粒细胞聚集及炎症损害程度的肺组织mpo活性显著高于正常对照组,与肺组织hmgb1表达密切相关,也提示了hmgb1在腹腔感染、内毒素血症时可引起肺组织炎症损伤。本实验应用安宫牛黄丸对脓毒症模型大鼠进行干预,观察其对肺组织hmgb1 mrna表达及急性肺损伤的可能作用。结果证实,安宫牛黄丸治疗能有效下调脓毒症大鼠肺组织hmgb1 mrna表达,并明显降低肺组织mpo活性,提示安宫牛黄丸可能通过抑制晚期炎症细胞因子hmgb1的合成与释放,减轻急性肺损伤,为中西医结合防治脓毒症所致器官功能损伤提供了新思路。

　　安宫牛黄丸出自我国清代著名温病学家吴鞠通著作《温病条辨》,具有清热解毒、芳香辟秽、开窍通闭之功效,对温病有独特的疗效,是中医治疗温热病的温病“三宝”之一。现代药理研究[13]表明,安宫牛黄丸具有抗炎、解热、复苏等作用。临床用安宫牛黄丸及类方治疗脓毒症取得较好疗效[14-15]。本实验结果显示,安宫牛黄丸对clp脓毒症模型大鼠的治疗作用与ag490、rpm等jak/stat信号通路抑制剂相似,可下调重要器官晚期炎症介质hmgb1的基因表达,减轻肺组织炎症损伤。通过抑制jak/stat通路减少重要器官炎症介质hmgb1的合成与释放,有可能是安宫牛黄丸防治脓毒症、保护重要脏器功能的重要作用靶点。

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