益智宁神口服液对抽动—秽语综合征模型大鼠神

【摘要】 【目的】观察益智宁神口服液对抽动—秽语综合征(ts)模型大鼠神经生物学和行为学的影响。【方法】选用spf级sd大鼠60只，随机分为空白组、模型组、中药组(益智宁神口服液，剂量为2ml/d)、西药组(氟哌啶醇，剂量为015mg/d)。除空白组外，其他组均采用亚氨基二丙腈(剂量为150mg·kg-1·d-1)腹腔注射复制ts大鼠模型，造模后第2天开始按设计剂量给药，观察各组大鼠运动行为及刻板运动评分，采用高效液相色谱法检测治疗14d后各组大鼠脑组织多巴胺(da)和去甲肾上腺素(ne)的水平。【结果】模型组运动行为、刻板运动积分以及脑组织ne水平均显著升高(p<001)，da水平显著降低(p<001);中、西药组治疗14d后均可降低大鼠运动行为、刻板运动积分及脑组织ne水平，升高脑组织da水平，与模型组比较差异均有显著性意义(p<005或p<001)，提示中药组作用与西药组相仿。【结论】益智宁神口服液治疗ts的作用与其能调整中枢神经递质的水平有关。

【关键词】 益智宁神口服液/药理学;抽动—秽语综合征/中药疗法;神经递质;疾病模型，动物;大鼠;色谱法，高压液相

　抽动—秽语综合征(tourette syndrome，ts)，又称多发性抽动症，是一种儿童期发病的慢性神经精神障碍性疾病。临床表现主要为突然、快速、反复、非节律性、不自主和刻板的运动性抽动和发声性抽动，还可能伴有各种行为紊乱、强迫观念与行为、认知障碍等，可不同程度地干扰和损害儿童的认知功能，影响社会适应能力。本病病因尚未明确，具有明显的遗传倾向，多见于4～12岁的儿童，患病率约为005%～3%，近年来发病呈明显上升趋势，男孩多于女孩[1]。广东省中医院儿科在临床实践中运用自拟方益智宁神口服液治疗该病，取得了较好的疗效[2]。本实验应用亚氨基二丙腈腹腔注射建立抽动—秽语综合征模型大鼠，观察该药对模型大鼠行为学和神经生物学的影响，现报道如下。

　　1材料与方法

　　11实验动物spf级sd大鼠60只，28～30d龄，体质量(250±10)g，雌雄各半。由广东省医学实验动物中心提供(许可证号:粤监证字2008d006，批号：0037766)。

　　12实验药品亚氨基二丙腈(iminodipropionitrile，idpn)购自alfa aesar公司(批号：c7323a)，中药益智宁神口服液(由广东省中医院提供，批号：080201)，对照药物为氟哌啶醇(上海信谊九福药业有限公司，批号：08031121)。

　　13仪器及试剂lc26a 型高效液相色谱仪、spd26av 荧光检测器、c2r4a 数据处理机均为日本岛津公司产品，脱水机、包埋机、切片机和生物显微镜等设备为德国leica公司产品，微量组织匀浆器为millipore公司产品，zh蓝星c/s型脑立体定位仪，高氯酸、乙二胺四乙酸二钠(edtana2)均为分析纯，甲醇为色谱纯，对照品由中国药品生物制品所提供。

　　14模型复制参考wakata[3]的方法，将亚氨基二丙腈溶解于生理盐水，稀释成浓度100mg/ml，给药途径为腹腔注射，剂量为150mg·kg-1·d-1，每天1次，共用7d。

　　15分组及给药选用sd大鼠随机分为4组：空白组和模型组各10只，中药组和西药组各20只，每组均雌雄各半。治疗组在造模后第2天开始给药，中药组按20kg的儿童每天口服20ml益智宁神口服液的比例计算，每只大鼠灌胃约2ml/d;西药组按20kg的儿童每天口服氟哌啶醇片1mg的比例计算，每只大鼠灌胃约015mg/d，连续14d。

　　16大鼠行为观察[4]采用观察评分，每次至少观察1h，主要诱发症状为运动行为和刻板运动。(1)运动行为评分：0分：安静或正常活动;1分：能过度兴奋;2分：探究行为增加;3分：跑;4分：跑和跳;(2)刻板运动(或定型运动)评分：0分：无刻板运动;1分：旋转行为;2分：头和颈部的上下运动过多;3分：头、颈部的上下运动过多加旋转行为;4分：头向侧摆合并头和颈部的上下运动过多。

　　17神经递质水平检测[5]第14天将所有实验大鼠迅速断头处死，借助脑立体定位仪，取右脑海马组织及边缘系统(包括纹状体、隔核、层壳核、基底节、齿状回)，精确称质量，置入1ml处理液(含01mol/l高氯酸和05g/ledtana2)中，微量组织匀浆器冰溶下匀浆，4℃冰冻离心10000r/min，取上清液置入-20℃保存。采用高效液相色谱法测定多巴胺(da)和去甲肾上腺素(ne)浓度。测样时，室温下解冻，进样20μl，以峰面积外标法定量。

　　18统计学方法采用spss130和sas913版本进行统计学处理和分析，各组神经递质水平检测数据分别进行方差齐性和正态分布检验，方差不齐采用秩和检验，检验水平α=005。

　　2结果

　　21各组行为学观察和评分各组治疗前后运动行为和刻板运动积分见表1。模型组行为学评分与空白组比较，差异有显著性意义(p<001)，表明造模是成功的。

　　治疗14d后，中、西药组运动行为积分和刻板运动积分降低，与模型组比较差异有显著性意义(p<005或p<001)，表明中药组和西药组对动物行为均有明显改善作用，中药组效果与西药组相仿。

　　22各组治疗前后脑组织da、ne含量变化比较表2结果显示：模型组脑组织da水平降低，ne水平升高，与空白组比较差异均有显著性意义(p<001);治疗14d后，中、西药组均可显著升高da水平，降低ne水平，与模型组比较差异均有显著性意义(p<005或p<001)，中药组作用与西药组相仿。表1各组治疗前后运动行为和刻板运动积分比较(x±s)　表2各组治疗前后神经递质水平比较

　　3讨论

　　idpn是一种中枢神经毒素，50年代以后就用于神经病理学的研究，本研究参考wakata[3]的方法复制模型，从神经生物学和行为学两方面观察药物治疗对ts模型动物临床行为学典型特征的影响。idpn诱发ts模型大鼠出现明显刻板运动和运动行为异常，如过度兴奋、探究行为、异常跑跳、旋转行为和头颈部上下侧摆等动作均具有ts临床行为学的典型特征，有时出现连续的嗤鼻、抬举上肢等动作，类似于人类ts患儿喉部发声、耸肩等特征行为。本研究通过对药物治疗前后ts模型大鼠运动行为和刻板运动行为评分的比较，发现中药组在改善动物ts典型特征行为方面效果明显，如头部、颈部的抽动减轻，旋转行为明显缓解，每次异常行为发作持续时间缩短，异常抽动次数消失，异常跑动及不规律的弹跳运动明显减少。

　　虽然目前对ts的神经生物学物质基础还未完全阐明，但基本认为中枢神经递质，特别是da、ne、5-羟色胺(5ht)等与ts之间关系密切[5]，因此，探讨大脑多巴胺类神经递质及其代谢产物的水平是证明药物神经生物学疗效的主要依据。本研究对大脑海马区da和ne水平进行测定，结果表明：治疗后中药组da水平明显升高，而ne水平有所下降，均趋向于正常水平。与ts有关的神经递质包括乙酰胆碱、肾上腺素、5ht、多巴胺等，主要分布于纹状体、隔区、蓝斑、黑质等海马、基底前脑及边缘系统，构成复杂的神经网络[6-8]。有关药物治疗对大脑组织不同部位和核团神经递质水平的影响文献报道并不一致，而且与检测时间点有很大关系[8]。本研究结果初步表明，中药治疗14d后，对大脑组织da和ne两种神经递质水平的变化产生显著影响，对于治疗过程中以及停药后神经递质的动态变化仍需进一步观察。

　　益智宁神口服液的主要组成为：熟地黄、黄芪、白芍、龙骨、远志、石菖蒲、五味子。其中熟地，其味甘，性微温，入心、肝、肾经，本品味厚气薄，为补血生精、滋阴补肾之要药，《珍珠囊》曰：“主补血气，滋肾水，益真阴”。黄芪，味甘，性微温，入脾、肺经，质轻升浮，为升阳补气之圣药。可补中气、益元气、温三焦、壮脾阳，选以补脾益气。白芍味苦、酸，性微寒，入肝经，既能养血敛阴，又能平抑肝阳，还能柔肝止痉;而龙骨味甘、涩，性微寒，入心、肝经，专攻平肝潜阳、镇静安神之用，两者搭配，养阴宁心，平肝潜阳。五味子性温，五味具备，酸能收敛，苦能清热，咸能滋肾，温而不燥，既能益气生津，补肾养心，用其养心滋肾安神;远志、石菖蒲有安神益智、化痰开窍之功效。诸药配伍，具有健脾滋肾、平肝熄风、宁神益智、化痰开窍之功效。氟哌啶醇是目前治疗ts的最有效药物之一[9]，疗效确切，但因副作用明显使其临床应用受到限制，通过实验结合临床用药发现，益智宁神口服液的疗效与氟哌啶醇无明显差异，且疗效更加稳定，易为患儿及家属接受。

【参考文献】
　[1] freeman r d， fast d k， burd l， et international perspective on tourette syndrome：selected findings from 3500 individuals in 22 countries[j].dev med child neurol， 2000，42( 7 )：436.

　　[2]杨丽新.培土抑木法治疗小儿抽动秽语综合征36例[j].浙江中西医结合杂志，2001，11(9)：575.

　　[3] wakata n， araki y， sugimoto h， et al. idpninduced monoamine and hydroxyl radical changes in the rat brain[j]. neurochemical research， 2000， 25(3):401.

　　[4]刘智胜.小儿多发性抽动症[m]. 北京:人民卫生出版社， 2002：237-238.

　　[5]刘师莲，张兆莲，刘贤锡，等. 大鼠脑组织单胺类递质及其代谢产物的检测方法研究[j].山东大学学报：医学版，2002，40(5):472.

　　[6]wong d，brasic j，singer h，et imaging of dopamine and serotonin in tourette syndrome[j]. neuroimage，2006，31(4)：162.

　　[7]swerdlow n r， sutherland a n. using animal models to develop therapeutics for tourette syndrome[j]. pharmacol ther，2005， 108(3):281.

　　[8]wong d f， brasic j r， singer h s， et al. mechanisms of dopaminergic and serotonergic neurotransmission in tourette syndrome: clues from an in vivo neurochemistry study with pet[j]. neuropsychopharmacology， 2008，33(6):1239.

　　[9]黄少武，李俊华.治疗量氟哌啶醇致锥体外系反应18例[j].实用医学杂志，2006，22(3):282.