不同极性石斛生物碱的提取分离及对人晶状体上

作者：魏小勇，马伟凤，方花，吴开力，王松，高欣欣

【摘要】 【目的】观察不同极性石斛生物碱对人晶状体上皮细胞(hlec)的保护作用。【方法】石斛粉末经乙醇提取、降膜浓缩、酸化、盐析、萃取后，水洗、回收提取分离不同极性生物碱。hlec用含体积分数10%胎牛血清的dmem培养液培养，石斛生物碱的保护作用实验分为10组：正常对照组，模型组，水溶性生物碱、脂溶性生物碱、低极性生物碱、弱极性生物碱高、低剂量组，剂量均分别为250、125μg/l;采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测不同极性生物碱对hlec增殖的影响。【结果】通过单因素实验，获得了影响不同极性石斛生物碱提取率的关键因素，均为体积分数80%乙醇提取3次，提取3h时提取率最高;模型组hlec增殖被h2o2明显抑制，低剂量脂溶性生物碱组细胞抑制率显著降低，与模型组比较差异有显著性意义(p<005)。【结论】较低剂量的脂溶性生物碱能更好地抑制h2o2对晶状体上皮细胞的氧化损伤。

【关键词】 石斛/分离与提纯;石斛/药理学;晶状体上皮细胞/病理学;细胞培养

　　石斛为兰科石斛属附生草本植物，《神农本草经》将其列为中药上品。《本草纲目》记载：金钗石斛可“强阴益精，厚肠胃，壮筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年”。生物碱是石斛重要的有效化学成分之一[1-4]。研究表明金钗石斛总生物碱具有抗肿瘤、抑制心血管和胃肠道的作用且能止痛退热[5-6]。前期研究表明石斛生物碱具有良好的抗白内障作用[7-9]。但生物碱的成分复杂[5]，为进一步确定其有效成分，本研究提取分离了不同极性的生物碱并比较其对人晶状体上皮细胞(hlec)的保护作用。对石斛生物碱提取工艺的各个关键步骤进行了探索，得到了较好的工艺条件，收率和含量都有了较大的提高。现报道如下。

　　1材料与方法

　　11细胞株人晶状体上皮细胞株sra01/04(hlec)由中山大学眼科中心提供。

　　12药材、试剂及仪器金钗石斛(贵州赤水信天石斛有限公司，广州中医药大学中药学院李薇教授鉴定)，新生小牛血清及dmem培养基(gibco公司)，二甲基甲砜(dmso，广州市康洋化工有限公司)，m193863mtt细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(北京中西远大科技有限公司)，胰蛋白酶(美国difco公司，上海生工生物工程公司代理)，薄层层析硅胶gf245(上海江莱实验设备有限公司)，其他试剂均为分析纯。pm6型倒置显微镜(日本olympus公司)，elx800型酶标仪(美国bio tek公司)，e52aa型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，shzd(ⅲ)型循环水式真空泵(河南巩义市英峪予华仪器厂)，bp221s型电子分析天平(上海精密仪器表有限公司)。

　　13不同极性生物碱的提取分离

　　131醇提与浓缩将无杂质的金钗石斛茎用清水洗净，然后烘干、粉碎，使其长约05cm;将打好粉的石斛放入10l的圆底烧瓶内，加入8倍体积的80%(体积分数，下同)乙醇，上接冷凝管，水浴锅保持在85℃，回流提取3次，每次3h;合并提取液进行降膜浓缩，浓缩至小体积后，用旋转蒸发仪在65℃时继续浓缩至无醇味，得到浓缩水液。

　　132酸化与盐析取1/3浓缩水液，用旋转蒸发仪在90℃时继续浓缩，将剩余的水分蒸干，得到黑色浸膏，将配好的体积分数5%盐酸溶液溶解浸膏进行酸化，边加边搅拌直至浸膏全部溶解，过滤酸水液。加入nacl晶体，边加边观察，直至饱和，此时有黑色黏稠状物质析出，过滤保存黑色黏稠状物质。

　　133氯仿萃取、水洗与回收过滤后的酸水液用氯仿萃取，萃取比例为3∶1即酸水液∶氯仿(3∶1，体积比，下同)，萃取10次。合并氯仿层，在旋转蒸发仪上回收氯仿至小体积。将回收至小体积的氯仿层用纯净水洗至中性，水洗比例即氯仿∶水(3∶1)，水洗20次。合并水洗后的氯仿层，用旋转蒸发仪在50℃时回收氯仿，可得脂溶性生物碱。取2/3浓缩水液，用氯仿萃取，萃取比例为3∶1即酸水液∶氯仿(3∶1)萃取10次。合并氯仿层，在旋转蒸发仪上回收氯仿至浸膏，得弱极性生物碱。

　　134碱化将酸化并用氯仿萃取后的酸水层用浓氨水调节ph在9～10之间进行碱化。氯仿萃取碱水层，萃取比例为3∶1，即碱水层∶氯仿为3∶1，萃取10次。合并氯仿层，在旋转蒸发仪上回收氯仿至小体积。水洗至中性，即得低极性生物碱。

　　135正丁醇萃取、水洗与回收将碱化并用氯仿萃取后的碱水液用正丁醇萃取，萃取比例为3∶1，即碱水液∶正丁醇为3∶1，萃取10次，合并正丁醇层，在旋转蒸发仪上回收正丁醇至小体积。用纯净水萃取正丁醇，萃取比例3∶1，即正丁醇∶水为3∶1，合并被正丁醇萃取后的水溶液(正丁醇饱和水)。用正丁醇饱和水萃取正丁醇层，萃取比例为3∶1，即正丁醇层∶正丁醇饱和水为3∶1，萃取10次。用旋转蒸发仪在65℃时回收正丁醇，即得水溶性生物碱。

　　136不同极性生物碱的检识分别将上述各极性生物碱浓缩至浸膏状，取不同极性生物碱浸膏各1mg,分别用1ml的水、乙醇、乙酸乙酯、石油醚溶解。结果表明4种物质均溶于乙醇和乙酸乙酯，其中极性最大者易溶于水，弱极性生物碱和脂溶性生物碱易溶于石油醚，低极性生物碱溶于乙醇和乙酸乙酯。生物碱提取率的计算公式为：p提取(%)=m生物碱/m干粗分×100%。

　　14不同极性生物碱对hlec增殖的影响

　　141培养试剂的配制用乙醇配制一定浓度的各极性生物碱储存液，使用时稀释至所需浓度，使乙醇终浓度不高于01%(体积分数，下同)，此浓度对细胞无影响。体积分数30% h2o2用无菌去离子水稀释至所需浓度。

　　142hlec的培养hlec用含体积分数10%胎牛血清的dmem培养液，置于37℃、体积分数5%co2培养箱内培养，细胞形态呈多角形或不规则形，3～4d可融合。融合成片的细胞，中央部分细胞呈六边形，大小较一致。细胞生长接近融合时及时传代或冻存，按1∶3或1∶4分瓶传代。

　　143分组与给药实验分为10组，即正常对照组：正常hlec+dmem;模型组：正常对照组+500μmol/lh2o2;水溶性生物碱高剂量组：模型组+250μg/l水溶性生物碱;水溶性生物碱低剂量组：模型组+125μg/l水溶性生物碱;脂溶性生物碱高剂量组：模型组+250μg/l脂溶性生物碱;脂溶性生物碱低剂量组：模型组+125μg/l脂溶性生物碱;低极性生物碱高剂量组：模型组+250μg/l低极性生物碱;低极性生物碱低剂量组：模型组+125μg/l低极性生物碱;弱极性生物碱高剂量组：模型组+250μg/l弱极性生物碱;弱极性生物碱低剂量组：模型组+125μg/l弱极性生物碱。

　　144四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测不同极性生物碱对hlec存活率的影响消化并收集生长良好、呈对数生长期的hlec,以含有体积分数10%胎牛血清的dmem培养液制成细胞悬液。接种于96孔板培养板中，每孔200μl，细胞浓度为8×103个/ml,置于37℃、体积分数5%co2培养箱中培养24h后，弃去培养液，加入无血清的dmem液，继续培养24h，使细胞同步化，24h后按143项下方法分组与给药。继续培养24h后，弃去培养液，在各组培养板分别加入200μlmtt试剂(终浓度为05mg/ml)。继续培养4h，吸去mtt溶液，加入150μldmso溶液，轻轻振荡10min后，于全自动酶标仪上490nm波长处测各组的吸光度(d)值，计算抑制率：p抑制(%)=(d正常对照组-d药物组)/ d正常对照组×100%。

　　15统计学方法应用spss130统计软件进行数据分析，数值变量两组间采用t检验或t′检验，多组间两两比较采用f检验，检验水平α=005。

　　2结果

　　21不同极性石斛生物碱提取分离的单因素分析

　　生物碱不溶或难溶于水而溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，因此，选用乙醇溶液作为提取溶剂。

　　211乙醇浓度的影响由图1可见金钗石斛各极性生物碱提取效果以80%为最佳，70%和90%浓度的乙醇生物碱提取率均低于80%。

　　图1乙醇浓度对不同极性石斛生物碱提取率的影响

　　figure 1effect of ethanol concentration on extracting rate of different polar hd alkaloids

　　212提取次数的影响图2可见，金钗石斛各极性生物碱提取率在提取1次时提取率较低，提取3次时提取率较高。而水溶性生物碱此种增长趋势不显著。

　　图2提取次数对不同极性石斛生物碱提取率的影响

　　figure 2effect of extracting times on extracting rate of different polar hd alkaloids

　　213提取时间的影响从图3可知，金钗石斛各极性生物碱提取率在提取1h时较低，提取3h时提取率较高。

　　综合上述因素，不同极性的溶剂均能有效地将不同极性的生物碱提取分离，提取率分别受提取溶剂浓度、提取次数和提取时间的影响。其中各极性生物碱均在体积分数80%乙醇，提取3次，提取3h时提取率最高。

　　图3提取时间对不同极性石斛生物碱提取率的影响

　　figure 3effect of extracting time on extracting rate of different polar hd alkaloids

　　22不同极性石斛生物碱干预对hlec生长情况的影响图4(彩图见第437页)结果显示，正常对照组hlec为克隆性贴附生长，细胞形态为扁平的多角形或星形。其生长特点为细胞之间紧密相靠、互相衔接，呈“铺路石”状连接成片。细胞多为单层，一般互不重叠，细胞透亮，胞浆丰富，胞膜清晰，且具有接触抑制和密度抑制现象，形成内密外疏的细胞群落(图4-a)，增殖明显且部分呈现跳跃式生长，与文献[10]报道一致。

　　各处理组hlec培育24h后，模型组的细胞形态表现多样，不规则细胞增多，渐渐变得肿胀，出现空泡和颗粒，逐渐死亡，细胞变得稀疏(图4-b);高、低浓度的水溶性、低极性、弱极性生物碱及高浓度脂溶性石斛生物碱组均表现一定细胞变形、肿胀、稀疏、死亡等(图4-c~j)，对hlec生长的抑制率较高。在低剂量脂溶性石斛生物碱组的培养基中，hlec较好地保持了原有细胞形态，细胞之间紧密相靠，互相衔接，排列规则，较少出现肿胀、空泡和颗粒等，细胞未见稀疏(图4-d)。因此，从细胞形态上来看，较低剂量的脂溶性石斛生物碱能较好地抑制h2o2对晶状体上皮细胞的氧化损伤。

　　表1结果显示：各组hlec培育24h后，加入mtt再培养4h，模型组hlec的增殖被h2o2抑制，高、低剂量的水溶性、低极性、弱极性生物碱及高剂量脂溶性石斛生物碱组对hlec增殖的抑制率均较高，与模型组比较差异无显著性意义(p>005)。在低剂量脂溶性石斛生物碱组中，细胞抑制率为4093%，存活率高，与模型组比较差异有显著性意义(p<005)，能较好地防止hlec凋亡。表1不同极性不同浓度的石斛生物碱对hlec增殖的影响结果

　　3讨论

　　糖尿病引起的晶状体混浊是常见并发症，其机制还不十分明确。实验研究表明：晶状体上皮细胞(lec)是糖尿病高血糖损伤的主要靶位，氧化应激是其发病的重要机制之一[11]。由于糖尿病患者晶状体蛋白质过度糖基化以及触发氧化应激性损伤，白内障病人和模型动物在晶状体出现混浊之前，lec先出现凋亡[12-13]。h2o2在糖尿病性白内障患者房水和晶状体内升高，干扰细胞结构蛋白质和高活性酶的dna功能，致lec的细胞核和线粒体结构及功能损伤，从而触发凋亡机制，细胞出现明显的凋亡现象[14]。本实验通过体外培养的人晶状体上皮细胞，利用h2o2模拟机体氧化损伤病理生理特点复制模型，24hhlec出现形态和数量的异常改变，生长受到抑制，细胞形态逐渐丧失原有特征，变得不规则、不均一、肿胀直至死亡，生长受到抑制，传代后容易老化，说明体外h2o2培养的晶状体上皮细胞具有类似于糖尿病白内障的晶状体细胞改变[15]。

　　生物碱是石斛的主要活性成分之一，前期研究表明石斛生物碱具有良好的抗白内障作用，并与抗氧化有关[9]。本实验中，经125μg/l脂溶性生物碱干预的氧化损伤的hlec较好地保持了上皮细胞的特征，细胞之间紧密相靠，排列规则，呈“铺路石”状连接成片，细胞死亡率明显下降，传代未见老化，从而证明较低浓度的脂溶性石斛生物碱对晶状体上皮细胞具有良好的保护作用，其机制可能与脂溶性石斛生物碱通过细胞膜渗入细胞内任何一个部位，激活细胞内氧化防御系统，干预lec氧化应激损伤，防止lec凋亡有关。确切机制尚有待进一步研究和探讨。

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