小儿复方木麻黄颗粒体外抗菌作用的实验研究
作者：王豪，唐菲，骆辉，张艳秋
【摘要】 目的：研究小儿复方木麻黄颗粒体外抑菌作用，为临床用药提供依据。方法：采用纸片琼脂扩散法、平皿稀释法考察小儿复方木麻黄颗粒的抑菌作用。结果：不同浓度的小儿复方木麻黄颗粒对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、绿脓杆菌均有一定程度的抑制作用，其对上述4种菌的最低抑菌浓度（mic）依次为：0.062 5、0.031 3、0.062 5、0.031 3 mg/ml。结论：小儿复方木麻黄颗粒体外具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、绿脓杆菌的作用。
【关键词】 小儿复方木麻黄颗粒；琼脂扩散法；平皿稀释法；最低抑菌浓度
［abstract］ objective: to investigate the antibacterial effects of pediatric compound horsetail beefwood granules in can be used for the theoretical s: to adopt agar plate diffusion and diluting process to carry on experimental observation of antibacterial effects of pediatric compound horsetail beefwood granules in vitro. results: the thing we used to restrain bacteria has certain inhibition effect against escherichia coli、staphylococcus aureus、shigella dysenteriae、pseudomonas aeruginosa,and mics of pediatric compound horsetail beefwood granules on these four kinds of bacteria were 0.062 5,0.031 3,0.062 5,0.031 3 sion: pediatric compound horsetail beefwood granules have obvious antibacteria action in vitro.
［key words］ pediatric compound horsetail beefwood granules; agar plate diffusion; diluting process; mic
小儿复方木麻黄颗粒由木麻黄、裸花紫珠两味药组成，是在海南黎族民间验方基础上研制而成的成方制剂，临床主要用于治疗腹泻与痢疾。木麻黄为木麻黄科木麻黄属植物，别名为驳骨松，黎族民间常用其枝叶治疗腹泻、痢疾，疗效显著。裸花紫珠为马鞭草科植物，具有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消肿的功能，黎族民间常用于治疗病毒性肝炎、上呼吸道感染以及内外伤出血等。本实验对复方木麻黄颗粒体外抗菌作用进行观察，为临床用药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
小儿复方木麻黄颗粒（由海南制药厂有限公司提供），规格：2g/袋(含浸膏0.5g)，批号：20050101。菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、志贺氏痢疾杆菌均为新近临床分离，由中国人民解放军第187医院检验科提供。培养基：营养肉汤培养基、营养琼脂培养基及牛肉膏汤琼脂培养基。
1.2 抑菌环直径大小的测定（琼脂扩散法）［13］
1.2.1 药物的配制 称取小儿复方木麻黄颗粒10 g，加注射用生理盐水至20 ml配制成0.5 g/ml的药液，然后稀释成1∶2、1∶4的药液，冰箱保存备用。
1.2.2 药敏纸片的制备 将普通定性滤纸用打孔机打成若干圆形纸片，直径为6.0 mm，置于干燥洁净的试管内，放入高压锅中经121.3 ℃、15 min高压灭菌后，取出放入恒温干燥箱内进行干燥。取经干燥后的纸片一定数量，每片吸取不同浓度的复方木麻黄溶液20 μl，置于37℃恒温箱中，待干，备用。
1.2.3 菌悬液制备 供试菌种经传代纯培养后，取一接种环菌接种于营养肉汤培养基中，37℃恒温培养6 h，菌液浓度相当于9亿个菌体/ml，1∶1000稀释后备用。
1.2.4 纸片琼脂扩散法 取直径12 cm平皿，倾入营养琼脂培养基15 ml，冷凝后用灭菌的棉拭子蘸取供试菌菌液均匀涂抹在培养基表面，室温放置2～3 min，用无菌镊子将在不同浓度的药液中浸润的纸片均匀间隔贴于各琼脂培养基表面，轻压纸片使接触良好，放入37℃恒温培养箱中，24 h后取出，观察抑菌圈，测量并记录结果。每个浓度的药物抑菌实验重复3次，抑菌结果为3次实验平均值。判定标准：抑菌圈直径小于9 mm为低度敏感，9.1～11 mm为中度敏感，11.1～15 mm为高度敏感。
1.3 最低抑菌浓度（ mic）的测定(平皿法)［4］
1.3.1 牛肉膏汤琼脂培养基的制备 100 ml蒸馏水内加入牛肉膏0.3 g, 蛋白胨1.0 g, 氯化钠0.5 g, 琼脂2.0 g, 加热溶解, 用氢氧化钠调ph值至7.2～7.6, 双层纱布过滤, 分装, 高压灭菌。
1.3.2 药物平板培养基的制备 取灭菌试管6支, 依次编号, 按无菌操作法,用移液管吸取无菌生理盐水加入各试管,每管3 ml, 然后吸取复方木麻黄颗粒溶液(1 g/ml)3 ml, 加入第1管, 并反复吹匀, 接着从第1管吸出3 ml, 放入第2管, 吹匀, 再从第2管吸出3 ml放入第3管。依此法按二倍稀释法稀释到第6管, 第1管至第6管依次被稀释成2、4、8、16、32和64倍, 分别为0.50、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3和0.015 6 g/ml。取7个无菌平皿编号, 2～7号平皿分别加入上述1～6管试管已稀释的药液2 ml, 1号平皿加入未稀释的药液2 ml, 然后向平皿内倒入已溶化并冷却至40℃左右的牛肉膏汤琼脂培养基18 ml,立即摇动平皿,使培养基和药液充分混匀,待琼脂凝固后,即为含药物的平板培养基, 其含药液的浓度分别为0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.031 3和0.015 6 g/ml。
1.3.3 细菌的接种和培养 将保存的各实验菌种分别接种在营养肉汤培养基内, 37 ℃生化培养箱中培养16 h,经比浊法判定菌量后，再用营养肉汤培养基稀释至含菌量为1×105 cfu/ml的菌悬液，将浓度为1×105cfu/ml菌液5μl点种于系列浓度含药平板上，并以不含药的平板点种做空白对照。接种好后放37℃生化培养箱中培养24 h取出,观察不同细菌在不同浓度的药物平板上的生长情况, 平板上有菌落生长用“+”表示，无菌落生长用“-”表示，使细菌不生长的最低浓度为药物对该菌mic。
2 结果
小儿复方木麻黄颗粒体外对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、绿脓杆菌有明显的抑制作用，抑菌作用的强弱随药物浓度的增加而变化(表1)，对4种菌的mic依次为：0.062 5、0.031 3、0.062 5、0.031 3 mg/ml(表2)。表1 小儿复方木麻黄颗粒不同浓度抑菌环直径的测定结果 表2 小儿复方木麻黄体外抑菌作用mic的测定结果
3 讨论
中医治疗痢疾的原则是清热导泻、调理气血、补脾健胃、杀虫止疾。木麻黄性味苦温，有祛风通络、益胃安神的功效；裸花紫珠味苦、涩性平，有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消肿、驱风祛湿的功效。实验研究表明：100% 裸花紫珠叶的煎液对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌敏感，对绿脓杆菌、伤寒杆菌、嗜盐菌及肠炎杆菌和脑膜炎双球菌较敏感，裸花紫珠片对引起上呼吸道感染的常见细菌有抗菌作用［5］。木麻黄、裸花紫珠两者合用可加强燥湿止泻止血之力，又可达到温化寒湿、行气导泻的作用。
本实验应用体外抗菌实验来考察小儿复方木麻黄颗粒的抗菌作用，该方法简便经济，是很便捷的初步筛选方法，但抗菌实验的结果容易受外界因素影响，如药物的种类、颜色、浓度等。为了避免纸片琼脂扩散法抑菌物浓度不同对扩散的影响以及比浊法受中药颜色的影响等因素干扰，本实验采用纸片琼脂扩散法、平皿稀释法同时进行体外抗菌实验研究，结果表明，小儿复方木麻黄颗粒对4种实验菌均有不同程度的抑菌作用。纸片琼脂扩散法实验结果表明，小儿复方木麻黄颗粒对金黄色葡萄球菌抑菌作用最强，其次为志贺氏痢疾杆菌、大肠埃希菌，对绿脓杆菌的抑菌作用最弱，其高浓度组抑菌环的直径依次为（26.00±0.82）mm、（14.33±0.62）、（11.50±0.41）、（10.67±0.67）mm。而平皿稀释法实验结果表明，志贺氏痢疾杆菌、大肠埃希菌的mic均0.062 5 mg/ml，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的mic均为0.031 3 mg/ml，可能是因为纸片琼脂扩散法中纸片吸收药物的浓度不同、药物扩散能力不一样等因素的影响，所以存在一定的误差。
【参考文献】
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