内皮型一氧化氮合酶基因多态性与冠心病关系

【关键词】冠心病；一氧化氮合酶,内皮；基因

　　摘要：目的探讨内皮型一氧化氮合酶(enos)基因内含子4可变串联重复序列(vntr)多态性与早发冠心病的关系。方法以医院为基础的病例对照研究，选择新诊断的冠心病患者为研究对象。男性≤55岁及女性≤65岁患冠心病为早发冠心病，以188例早发冠心病患者为病例组，315例迟发冠心病患者为对照组。应用聚合酶链反应(pcr)技术检测enos基因内含子4vntr多态性。结果enos基因内含子4vntrc/c、c/b、b/b、b/a、a/a基因型频率，早发冠心病组分别为053%，000%，8138%，1649%，160%；迟发冠心病组分别是000%，032%，7746%，2032%，190%。c/c+c/b+b/b与b/a+a/a基因型在2组之间分布差异无统计学意义(p=0268，or=1294，95%ci=0820～2043)。c、b、a等位基因频率，早发冠心病组分别是053%，8963%，984%；迟发冠心病组分别是016%，8778%，1206%。c+b与a的等位基因频率在2组间分布差异无统计学意义(p=0280，or=1257，95%ci=0830～1904)。在α=005显著性水平上，用多元逐步非条件logistic回归分析调整性别、吸烟、饮酒、收缩压、体质指数、腰臀比、甘油三酯和总胆固醇后，enos基因内含子4vntr多态性与早发冠心病也无显著相关(p=0427,or=0819,95%ci=0500～1341)。结论enos基因内含子4vntr多态性可能不是早发冠心病发病的危险因素。

　　关键词：冠心病；一氧化氮合酶，内皮；基因

　　associationbetweenpolymorphismofendothelialnitricoxidesynthasegeneandcoronaryheartdisease

　　humaohong，jiachongqi，liutongtao，etal.

　　departmentofepidemiologyandhealthstatistics,schoolofpublichealth,shandonguniversity(jinan250012,china)

　　abstract：objectivetoassesstheassociationbetweenintron4vntrpolymorphisminendothelialnitricoxidesynthase(enos)geneandprematurecoronaryheartdisease(p-chd).dredandeighty-eightchdpatientsdiagnosedat/before55yearsoldformalesand65forfemaleswereapesweredetectedbypolymorphismchainreaction(pcr)sthegenotypefrequenciesofc/c,c/b,b/b,b/a,a/awere053%,000%,8138%,1649%,160%inp-chdgrouprespectivelyand000%,032%,7746%,2032%,190%asnosignificantdifferencebetweenthep-chdandthecontrolgroupforcomparinggenotypefrequenciesofc/c+c/b+b/bwithb/a+a/a(p=0268,or=1294,95%ci=0820～2043).theallelefrequenciesofc,b,awere053%,8963%,984%inthep-chdgrouprespectivelyand016%,8778%,1206%asalsonosignificantdifferencebetweenthep-chdandthecontrolgroupforcomparingallelefrequenciesofc+bwitha(p=0280，or=1257，95%ci=0830～1904).stepwisemultiplelogisticregressionanalysisat005significantlevelwithadjustmentofsex,smoking,alcoholdrinking,systolicbloodpressure,overweight,waist-hipratio,serumtriglyceride,serumtotalcholesterolcovariatesshowedthattheenos4ahadnosignificanteffectonp-chd(p=0427,or=0819,95%ci=0500～1341).conclusionenosintron4a/bvntrpolymorphismisnotariskfactorforp-chd.

　　keywords：coronaryheartdisease;nitricoxidesynthase;endothelial;gene

　　遗传因素在冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病chd)发病中具有重要作用，但早发与迟发病例在遗传背景方面存在较大差异，其中，内皮型一氧化氮合酶(enos)基因对冠心病具有重要作用〔1〕。enos基因内含子4存在27bp的可变串联重复序列(vntr)，研究显示，这种多态性与机体一氧化氮(no)的代谢水平密切相关〔2〕。为探讨enos基因内含子4vntr多态性与早发冠心病之间的关系，本文对188例早发冠心病及315例迟发冠心病进行观察比较。结果报告如下。

　　1对象与方法

　　11对象选择2002年6月～2005年6月山东大学附属医院心内科确诊的新发病例503例，均符合1979年who制定的关于缺血性心脏病的诊断标准〔3〕，以男性≤55岁及女性≤65岁患有冠心病者为早发冠心病。以早发冠心病188例为观察组，平均年龄(511±776)岁；迟发冠心病315例为对照组，平均年龄(697±802)岁。

　　12方法

　　121现场调查(1)问卷调查：内容包括年龄、性别、既往病史、吸烟史和饮酒史；体检包括身高、体重、腰围、臀围、收缩压(sbp)和舒张压(dbp)；并按体重/身高2(kg/m2)计算体质指数(bmi)，按腰围/臀围计算腰臀比(whr)。(2)采集血样：抽取调查对象空腹肘静脉血5ml，其中1ml用乙二胺四乙酸二钠盐(edta)-na抗凝，用于基因组dna提取；4ml分离血清，用于血清学检测。(3)血清生化指标检测：血清甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)用酶法测定，试剂盒由(北京中生生物工程高技术公司。)

　　122基因组

dna提取用十二烷基硫酸钠(sds)及蛋白酶k消化，酚/氯仿提纯，乙醇沉淀。

　　123enos基因内含子4vntr多态性检测以提取的dna为模板，根据设计的上、下游引物，用pcr方法特异性扩增含有可变串联重复序列的片段。引物序列，上游5′-ctcagcccagtagtgaagac-3′；下游5′-gcttctcttagtgctgtggt-3′。pcr反应体系总体积为30μl，其中含模板100ng，引物各03μmol/l，50mmol/lkcl，15mmol/lmgcl2，10mmol/ltris-hcl(ph=84)，015mmol/ldntps，15uextaqdna聚合酶(takara)。反应条件为95℃预变性5min，33个循环中95℃变性45s，58℃退火60s，72℃延伸45s，最后72℃延伸5min。pcr产物用8%的聚苯烯酰胺电泳，银染色观察实验结果。根据片段数量与长度进行基因型分析。

　　13统计分析用spss115及stata82软件进行分析，计数资料用χ2检验；计量资料用两样本均数比较的t检验；多因素分析用多元逐步非条件logistic回归。

　　2结果

　　21一般情况(1)早发冠心病组男性104例，女性84例，性别比为124∶1；迟发冠心病组男性221例，女性94例，性别比为235∶1。早发冠心病组吸烟者73例，吸烟率为388%；迟发冠心病组吸烟者92例，吸烟率为292%。早发冠心病组饮酒者44例，饮酒率为234%；迟发冠心病组饮酒者45例，饮酒率为143%。其中性别比、吸烟率、饮酒率等差异均有统计学意义(p<005或p<001)。(2)2组检测指标比较：早发冠心病组收缩压/舒张压分别为(12747±1810)/(7922±1100)mmhg；迟发冠心病组为(13151±2339)/(7759±1284)mmhg。早发冠心病组体质指数为(2632±316)kg/m2，迟发冠心病组为(2496±369)kg/m2。早发冠心病组腰臀比为090±007，迟发冠心病组为088±007。早发冠心病组血清甘油三酯为(202±132)mmol/l，迟发冠心病组为(156±094)mmol/l。早发冠心病组胆固醇含量为(539±111)mmol/l，迟发冠心病组为(517±116)mmol/l。2组的收缩压、体质指数、腰臀比、血清甘油三酯和胆固醇含量等差异均有统计学意义(p<005或p<001)。

　　22enos基因内含子4vntr基因型及等位基因频率分布(表1)(1)将enos基因内含子4的vntr多态性按不同等位基因分析，4次串联重复序列等位基因记为enos4a；5次串联重复序列野生型等位基因记为enos4b；6次串联重复序列等位基因记为enos4c。pcr结果显示，共扩增出5种基因型，其中：a/a片段长度为425bp；b/a2个片段长度分别为452和425bp；b/b片段长度为452bp；c/b2个片段长度分别为479和452bp；c/c片段长度为479bp。(2)为观察enos4a基因型与冠心病的相关性，将enos4a与enos4b及enos4c进行基因型与等位基因频率分析。结果可见，c/c+c/b+b/b(合并后的频数与频率，早发冠心病组为154与8191%；迟发冠心病组为245与7778%)，与b/a+a/a(合并后的频数与频率，早发冠心病组为34与1809%；迟发冠心病组为70与2222%)，经比较，χ2=1229，p=0268，or=1294，95%ci=0820～2043；c+b(合并后的频数与频率，早发冠心病组为339与9016%；迟发冠心病组为554与8794%)与a(频数与频率，早发冠心病组为37与984%；迟发冠心病组为76与1206%)，经比较，χ2=1167，p=0280，or=1257，95%ci=0830～1904，差异均无统计学意义。

　　表1enos基因内含子4vntr基因型及等位基因频率（略）

　　23enos基因内含子4vntr多态性与早发冠心病关系多因素分析(表2)在α＝005显著性水平上，用多元逐步非条件logistic回归筛选性别、吸烟、饮酒、收缩压、bmi、whr、甘油三酯、总胆固醇等有显著影响的可能混杂因素，并将enos基因内含子4vntr纳入模型，以探讨在控制可能的混杂因素后enos基因内含子4vntr多态性的效应。表2可见，enos基因内含子4vntr多态性与早发冠心病无显著性相关。

　　表2enos基因内含子4vntr多态性与早发冠心病关系的多元logistic回归分析（略）

　　注：vntr：c/c+c/b+b/b与b/a+a/a比较；bmi≥240为1

　　3讨论

　　目前，虽然国内外对enos4a/bvntr多态性与冠心病之间的关系研究较多，但结果相差甚远。有资料认为〔4,5〕，enos4a等位基因能显著升高冠心病的发病危险性。有研究表明〔6〕，enos4a/bvntr多态性与冠心病无显著性相关，但有资料显示〔7〕，enos4a等位基因对冠心病的发病具有显著的保护性作用。尽管导致现有资料结果相互矛盾的原因众多，但各研究所选研究对象年龄的不同可能是其原因之一，因为早发冠心病与迟发冠心病在遗传背景方面存在巨大差异。lee等研究显示〔5〕，只有在年龄＜51岁的人群中，enos4a/bvntr多态性与冠心病之间的关系才具有显著性。本研究结果显示，无论单因素分析还是多因素分析调整潜在的混杂因素后，enos4a/bvntr多态性与早发冠心病之间均无显著性相关。唐欧杉等〔8〕选择年龄匹配的健康者作为对照组，结果显示，enos4a/bvntr多态性与早发冠心病之间也无显著性相关，与本研究结果一致。关于enos4a/bvntr多态性是否引起enos的功能改变目前尚无定论。虽然有资料显示〔2〕，enos4a基因携带者血浆no水平显著降低，但是enos4a等位基因与enos基因t-786c变异存在显著的连锁不平衡〔9〕，而enos基因t-786c变异能显著降低enos基因启动子

活性〔10〕。因此，关于enos4a/bvntr多态性仅仅是一个遗传标记，还是与冠心病发生相关的因素，以及其与冠心病之间的关系如何尚须进一步深入研究。

　　参考文献

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　　〔2〕tsukadat,yokoyamak,arait,ceofassociationoftheecnosgenepolymorphismwithplasmanometabolitelevelsinhumans［j］.biochembiophysrescommun,1998,7,245:190-193.

　　〔3〕第一届全国内科学术会议心血管病组.关于冠状动脉性心血管病命名及诊断标准的建议［j］.中华心血管病杂志,1981,9:75-77.

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　　〔7〕parkkw,youkh,ohs,ationofendothelialconstitutivenitricoxidesynthasegenepolymorphismwithacutecoronarysyndromeinkoreans［j］.heart,2004,90:282-285.

　　〔8〕唐欧杉,徐耕,秦丰明,等.内皮型一氧化氮合酶基因多态性和早发冠心病的相关性研究［j］.岭南心血管病杂志,2004,10:293-296.

　　〔9〕yoshimuram,yasueh,nakayamam,criskfactorsforcoronaryarteryspasm:significanceofendothelialnitricoxidesynthasegenet-786>candmissenseglu298aspvariants［j］.jinvestmed,2000,48:367-374.

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　　(孔繁学编辑刘铁校对)

　　*基金项目：山东省卫生厅科研基金资助项目（hz036）

　　作者单位：山东大学流行病与卫生统计学研究所,济南250012;山东大学齐鲁医院心内科