2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白转染体外培养神

【摘要】 目的 探讨2型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 2, raav-2）载体能否有效地转染nscs。 方法 采用含有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, egfp）报告基因的raav-2（raav-2/egfp），以感染复数（multiplicity of infection, moi）分别为1×104、1×105、1×106转染体外分离、培养的大鼠胎鼠nscs，在荧光显微镜下观察egfp的表达；同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况来评估对其存活、增殖、分化能力的 影响 ；当egfp表达稳定后，流式细胞仪检测raav-2/egfp对nscs的转染效率。结果 转染10天后各转染组便可观察到nscs克隆球发出绿色荧光，起始荧光强度不一，随moi值的增大而增强；各转染组荧光强度随时间的延长而逐渐增强，至转染21天后达高峰并维持，此时流式细胞仪检测raav-2对nscs的转染效率：moi为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%, 荧光指数（fi）分别为4.08、12.72、14.06；转染组和未转染组细胞培养7、14、21天时其细胞活力、增殖倍数、分化差异均无显著性。结论 raav-2能有效地转染nscs，所介导的目的基因能高效表达。

【关键词】 神经干细胞；2型腺相关病毒；转染；感染复数；绿色荧光蛋白；荧光指数；细胞活力

【abstract】 objective to investigate the transfection efficiency of recombinant adeno-associated virus 2 （raav-2） in cultured neural stem s the neural stem cells of rat embryo cultured, indentified in vitro was infected with the raav-2 expressing the enhanced green fluorescent protein（egfp） gene by different multiplicity of infection（moi=0,1×104,1×105,1×106 ）. after transfection, the expression of egfp was detected by fluorescent microscope. at the same time, the cytotoxicity of raav-2 to nscs was evaluated by cell proliferation, cell vitality and cell differentiation. the tranfection efficiency was evaluated by flow s egfp was initially expressed in the neural stem cells-drived neurosphere of all transfected groups 10d following infected by level of expression increased with the increase of moi, subsequently gradually increased and reached peak on ection efficiency and fluorescent index （fi） were 25.68%, 4.08 （moi=1×104）; 50.60%, 12.72 （moi=1×105）; 56.72%, 14.06 （moi=1×106） respectively. during the period of the culture, cell proliferation, cell vitality and cell differentiation in the transfected and untransfected group had no sions the raav-2 can transfect neural stem cells efficiently, and the raav-mediated transfer of the gene can be expressed in the nscs.

【key words】 neural stem cells；recombinant associated adeno virus 2; transfection; multiplicity of infection; green fluorescent protein; fluorescent index；cell vitality

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，gfp）基因是一种新的报告基因，由于其表达产物gfp可被直接激发产生荧光，不需要任何底物或辅助因子，较传统的标记基因如β2-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等更具有明显的优越性；在gfp的基础上进行f64l和s65t的突变从而形成增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，egfp），egfp增强了gfp的荧光性能，更容易观察、检测［1］。2型腺相关病毒具有与人类疾病无相关性、宿主范围广、可整合入细胞染色体dna介导外源基因长期表达等优点,是较理想的基因载体［2］。随着神经干细胞（neural stem cells，nscs）的分离、培养、纯化及生物学功能 研究 深入［3～5］，寻找nscs基因修饰载体及标记分子，已成为研究nscs在体内、外分化调控和细胞工程基因 治疗 中枢系统疾病的研究热点。运用基因修饰神经干细胞治疗中枢系统疾病具有细胞修复和转基因治疗的双重优势。理想的基因转移载体是基因修饰的关键。

1 材料与方法

1.1 病毒载体 raav-2/egfp购于863生物领域病毒基因载体研究开发基地、北京本元正阳基因技术股份有限公司，滴度为5×1011v.g/ml。

1.2 神经干细胞分离、培养、鉴定［6］ 按 参考 文献 进行，体外分离胚胎大鼠大脑额叶皮质、悬浮培养，经nestine鉴定为神经干细胞（见图1），作为实验细胞株。

1.3 主要试剂、仪器 dmem/f12培养液、胎牛血清（hyclone公司产品）；表皮生长因子（egf）、碱性成纤维生长因子（bfgf）（sigma公司产品）；兔抗巢蛋白nestin抗体、罗丹明标记山羊抗兔二抗（北京中杉金桥公司产品）。相差倒置显微镜（cannon）、倒置荧光显微镜（nikon）、细胞计数板、co2培养箱、超净台、流式细胞仪（bd）。

1.4 raav-2/egfp体外转染神经干细胞

1.4.1 分组 取生长良好的nscs，机械反复轻柔吹打分散、200目不锈钢筛网过滤制备成单细胞悬液，以1×105个细胞/孔接种于4块6孔培养板中，分别按感染复数（moi）（v.g/cell）=0、1×104、1×105、1×106转染，设四组，其中moi=0作为未转染对照组。

1.4.2 转染 转染时先按moi值 计算 所需加入raav-2/egfp病毒载体的体积数，在试管中将所需加入raav-2/egfp病毒载体与dmem/f12培养液混合形成转染液，将每组对应孔中加入相应的2ml转染液，moi=0作为未转染对照组，同样操作但不转染raav-2/egfp，37℃，5%co2培养箱培养2h后，1000r/min离心5min，如此dmem/f12清洗细胞2次，弃病毒残液，补充完全细胞培养液（dmem/f12加2%b27，20ng/ml的egf、bfgf）5ml，37℃，5%co2培养箱培养，常规换液、传代。在倒置荧光显微镜下观察、记录raav-2/egfp转染nscs后egfp的表达情况。

1.5 raav-2/egfp体外转染对神经干细胞存活、增殖、分化的影响 raav-2/egfp转染nscs后，各组分别在7、14、21天细胞传代时台盼兰拒染法检测细胞活力、细胞计数计算增殖倍数。0.2%台盼兰溶液与细胞悬液混匀，死细胞着色，而活细胞不着色，计数活细胞数及死细胞数。细胞活力为活细胞数/（活细胞数＋死细胞数）。egfp表达稳定时，10％胎牛血清诱导各组nscs克隆球分化，观察分化情况。

1.6 流式细胞仪检测基因转染率和表达效率［7］ raav-2/egfp转染nscs后，各组在各相应的时间点细胞机械反复轻柔吹打分散、200目不锈钢筛网过滤制成单细胞悬液，上流式细胞仪（bd），以未转染组为对照，激发光为488nm、吸收光为530nm，进行数据获取与 分析 ；分析结果用转染率和荧光指数（fluorescent index，fi）表示。转染率即egfp阳性细胞的阳性率，荧光指数主要反映了目的基因的表达效率。

每一样品收集1×104个细胞，根据细胞大小设定一个单细胞区域，该区域的细胞用于荧光分析。以未转染组的细胞作为阴性对照，设定gfp阳性细胞区（m1区）使阴性对照m1区细胞数不超过0.1%，流式细胞仪分析结果用转染率和荧光指数fi表示。转染率即为gfp阳性细胞阳性率，fi主要反映了目的基因的表达效率，分别用下列公式计算：转染率=样品 m1区细胞百分率 －阴性对照m1区细胞百分率；fi=样品m1区细胞百分率样品×m1区平均荧光强度 － 阴性对照 m1区细胞百分率×阴性对照m1区平均荧光强度。在上述两个公式中，减数很小，一般情况下可忽略不计。

1.7 统计学处理 各组数据均用x±s表示，组间比较用单因素方差分析，实验数据用统计软件spss11.0进行统计学处理。

2 结果

2.1 raav-2介导的egfp基因在nscs中的表达 raav-2/egfp转染nscs，10天后egfp开始表达，倒置荧光显微镜下可见各转染组神经球受蓝色光激发产生的呈团块状的绿色荧光，但较弱且强度不一，总体上感染复数越大荧光越强；随后表达显著增加，21天时达高峰，这时荧光较强（见图2），表明细胞球中多数细胞被转染并成功表达egfp，细胞继续传代培养，仍可见大量荧光。

2．2 raav-2对神经干细胞活力、增殖、分化的影响 不同moi的raav-2转染组和未转染对照组的nscs在倒置显微镜下观察，均生长良好，细胞透光性好，形态完整，细胞碎片少，nscs形成克隆球速度相当，细胞稳定性好，可连续传代，各组细胞在7、14、21天台盼兰拒染法检测细胞活力差异均无显著性（p＞0.05）（见表1）。同时各组细胞在7，14，21天细胞计数从而计算增殖倍数，转染组与未转染对照组在相应时间点差异亦无显著性（p＞0.05），并在培养过程中呈指数生长趋势（见表2）。 表1 raav-2转染对nscs活力的影响注：均为同一时间点转染组和未转染组对照比较，组间比较p＞0.05，差异无显著性表2 raav-2转染对nscs增殖倍数的影响注: 均为同一时间点转染组和未转染对照组比较，组间比较p＞0.05，差异无显著性。

egfp表达稳定时，10％胎牛血清诱导各组分化后，各组均可见神经干细胞克隆球在含10%胎牛血清的dmem/f12培养基中6h左右细胞克隆球贴壁，12h后即发现有突起从团块边缘长出，24h后见有少数细胞从克隆球的边缘向外迁移，分化为有突起的细胞，有的细胞迁移速度较快，以后分化的细胞逐渐增多，从克隆球周围迁移出，呈放射状排列，随着时间的推移，突起不断增粗与延长并互相连接成网状，1周以后，各组nscs克隆球几乎完全分化，形成大量胞体呈圆形或椭圆形、具有1～2细长突起的神经元样细胞和胞体较大、形态不规则、具有多个粗突起的星形胶质样细胞。map-2、gfap免疫荧光分别鉴定分化细胞，荧光显微镜下各组均可见map-2阳性的神经元和gfap阳性的神经胶质细胞。raav-2转染的神经干细胞不仅可以分化为神经元和胶质细胞，细胞形态保持正常，且转染不影响神经元和胶质细胞的分化比例。各组map-2、gfap阳性细胞比例见表3，差异均无显著性（p值均＞0.05）。表3 不同moi转染组和未转染对照组map-2、gfap阳性细胞的比较注：组间比较p>0.05，差异无显著性

2.3 raav-2对神经干细胞的转染效率 egfpegfp开始表达后，于14、21、28天流式细胞仪检测各moi的raav-2/egfp转染nscs的效率（见表4）：可见21天为其表达高峰，此时moi为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%（见图3），荧光指数（fi）分别为4.08、12.72、14.06。表4 不同moi的raav-2/egfp转染nscs的效率
3 讨论

近年来，神经干细胞的 研究 发展 迅速，但仍存在许多 问题 ，如细胞移植时常常不能区别供体细胞与宿主细胞，不能较精确地观察植入细胞的存活及生长分化情况，也就难以对脑内移植的功效作出一个客观评价。随着基因工程技术的发展，人们可根据不同的科研及 治疗 目的，对神经干细胞进行不同的遗传学修饰，以期制成基因工程细胞，这些细胞极具科研和 应用 价值，受到广泛关注。病毒载体和非病毒载体是 目前 基因修饰中常用的两大类载体。非病毒载体有脂质体、质粒、分子偶联载体等，基因转移效率低。病毒载体应用最广泛，约占85%，其中腺相关病毒、逆（反）转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒是基因治疗中最常用的4种病毒载体，病毒载体安全性问题至关重要［8］。各种病毒载体都有自己的优点和不足，但是逆（反）转录病毒是随机整合入宿主dna、可能会引起“插入诱变”、也有可能产生具有复制能力的病毒［9］；腺病毒不能整合到宿主染色体dna上，表达时间短暂，所以不能持续表达所需产物，且可能刺激免疫反应［10］；单纯疱疹病毒对人类具有明显的致病性，能够从潜伏状态激活［11］。而aav-2是一种单链的微小dna病毒，需要辅助病毒才能有效地复制，具有与人类疾病无相关、宿主范围广，并能整合入宿主细胞dna，去除其复制蛋白rep和包装蛋白cap基因,仅具有感染宿主的功能,安全性较高,成为较理想的基因修饰载体,倍受瞩目。其具有下列优点:目前尚未发现该病毒在人体中致病,所以比较安全；感染宿主细胞广泛,包括非分裂细胞和分裂细胞,特别是神经元和神经胶质感染性较强；能特异整合于人的第19号染色体长臂末端，减小了插入突变激活原癌基因的可能性，raav虽然失去了整合特异性，但反向末端重复序列中没有转录调控组件，因而减少了插入突变的可能性；外源基因表达稳定，可长达2年［2，12］。nscs具有自我复制、增殖分化的能力，是基因修饰、基因治疗的靶细胞。

aav-2能否有效地转染神经干细胞，且转染raav-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等有无 影响 ，值得探讨。因为如果转染raav-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等天然性能产生影响，都会对细胞、机体造成严重后果，那么将会极大地限制其在基因修饰、基因治疗方面的应用。许多学者采用aav转染神经干细胞，得到的结果各不相同。hughes等［13］研究认为raav-2对神经干细胞球略有效率低下的转染能力，其仅观察5天转入基因的表达情况，而腺相关病毒转染细胞后基因表达的高峰期为1个月左右，转入基因5天时可能没有表达或者表达量很少。本实验分离培养了大鼠胚胎源性神经干细胞，用raav-2/egfp转染nscs，对其进行基因修饰，我们的结果提示：转染raav-2对神经干细胞存活、增殖、分化能力等未产生影响，raav-2 对神经干细胞没有毒性作用，不影响神经干细胞的生物学特性，是神经干细胞间接体外法基因治疗的理想载体；moi=1×104、1×105、1×106转染10天后，egfp开始表达，荧光显微镜下可见弥漫于整个nscs克隆球中的绿色荧光，起始表达强度不一，随moi值的增大而增强，而且egfp的表达强度随着时间的延长而逐渐增强，至转染后第21天达到高峰并维持,此后荧光指数不再增大；此时行流式细胞仪检测：moi为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%,荧光指数（fi）分别为4.08、12.72、14.06。仅以转染率不能够全面衡量一个基因载体的转移效率，无法反映多拷贝基因转移，也不能反映目的基因的表达效率。荧光指数能更为全面地反映基因转移和表达效率；以gfp基因为报告基因，用流式细胞仪 分析 基因转移效率（转染率和荧光指数）优于传统人工计数法，并且还可用流式细胞仪进一步筛选表达egfp阳性的细胞。aav是通过靶细胞膜上的表面肝素聚糖蛋白（surface heparin protein of glycans,shpg）为受体介导转染的［14］，而受体的数目和功能是有限的，当aav与受体结合达平衡时，发挥最大生物效应，再增大moi也不会提高转染效率。因此我们可以解释raav-2/egfp转染nscs的效率随moi值的增大而增强，但moi为1×105、1×106转染效率相差不大，可能是aav与受体结合达到了平衡，转染达到了稳定，结合实验 经济 因素，因而moi=1×105为最佳moi。另外，还有可能是由于神经干细胞aav受体表达强弱、培养 方法 、转染时间、检测方法的不同等因素，引起不同学者实验研究结果上的差异。

gfp相对分子质量小，这也是它作为报告基因的一大优点；gfp与目的基因融合后对目的基因的结构功能没有影响，大量表达对细胞也无毒性作用。在我们的研究基础上，将raav-2/egfp与一些促进nscs存活和定向分化的营养因子，如gdnf、vegf等目的基因构建成融合基因，以gfp基因为报告基因，raav-2为载体，一起转染移植的nscs，不需用其他检测方法，只需荧光显微镜下观察gfp的表达情况，便可针对另一基因作相关研究，将对中枢系统的研究手段有更好的应用价值。

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