外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转

【摘要】 目的： 探讨外源性结缔组织生长因子（ctgf）在人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成中的作用. 方法： 将体外培养的人肾小管上皮细胞hk2分为三组：对照组；ctgf小剂量组（终浓度为2.5 μg/l）；ctgf大剂量组（终浓度为20 μg/l）. 用倒置显微镜观察细胞形态学变化；噻唑蓝（mtt）法检测细胞增殖活性；rtpcr检测hk2细胞e钙黏蛋白（ecadherin），α平滑肌肌动蛋白（αsma），纤连蛋白（fn）和胶原ⅰαmrna水平的变化；免疫组织化学方法观察hk2细胞fn和胶原ⅰ的表达. 结果： ctgf刺激使hk2 细胞由椭圆形变为梭形，同时促进hk2细胞增殖. 不同浓度的ctgf作用于hk2细胞48 h后，αsma 和fn mrna水平显著升高（p<0.05），e钙黏蛋白mrna的表达显著下降（p<0.05）；大剂量ctgf刺激hk2细胞48 h后胶原ⅰαmrna水平显著升高（p<0.05）. 小剂量ctgf组hk2 细胞胞质fn表达水平显著增加（p<0.05），大剂量ctgf组hk2细胞胞质表达fn和胶原ⅰ均显著增加（p<0.05）. 结论： ctgf在体外能够诱导人肾小管上皮细胞转分化，并促进fn的合成，大剂量的ctgf可以增加其胶原ⅰ的合成.

【关键词】 结缔组织生长因子；肾小管；上皮细胞；转分化；细胞外基质

　　大量证据表明，肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞（epithelialmyofibroblast transdifferentiation, emt）是肾间质纤维化发生机制之一［1］. 结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, ctgf）是近年来发现与肾纤维化密切相关的细胞因子. 在新月体肾小球肾炎，iga肾病，局灶性节段性肾小球硬化以及糖尿病肾病的肾活检标本中发现ctgf表达增高，多种肾纤维化动物模型也证实存在ctgf表达上调［2］. 目前较多研究证实，ctgf作为转化生长因子β（tgfβ）的主要下游因子，参与了emt的发生与发展，但有关ctgf对肾小管上皮细胞直接作用的机制仍不十分明确. 本研究我们探讨外源性ctgf能否诱导人肾小管上皮细胞发生转分化及对细胞外基质合成的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　细胞： 正常人肾小管上皮细胞（hk2）购自中国武汉典型培养物保藏中心. 主要试剂：重组人ctgf蛋白（rhctgf, peprotech），dmem/f12培养基，hepes(gibcol),胎牛血清（杭州四季青公司）；rna抽提试剂trizol（invitrogen），逆转录试剂盒（promega）,taq酶，dna maker(takara ),羊抗人胶原ⅰαpab（1∶200，santa cruz）,小鼠抗人fn mab（1∶200，neomarkers），hrp标记兔抗羊二抗，hrp标记兔抗小鼠二抗，（1∶200），dab显色液（武汉博士德公司）；mtt（美国sigma公司）；图像分析处理系统（美国uvp公司）；聚合酶链反应引物：均由invitrogen公司合成 (表1). 表1引物序列（略）

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养及分组将hk2细胞用含100 ml/l fbs的dmem/f12培养液传代培养，培养条件为37℃，50 ml/l co2 . 0.5 g/l胰酶＋0.2 g/l edta消化细胞后，1×108/l细胞接种于50 ml塑料培养瓶. 先以100 ml/l fbsdmem/f12培养细胞，70%～80％融合时改用无血清培养基培养24 h，使细胞生长同步化. 弃去培养液，将hk2细胞分为三组. 对照组：加无血清dmem/f12培养液；小剂量ctgf组：在无血清dmem/f12培养液中加入ctgf（终浓度为2.5 μg/l）；大剂量ctgf组：在无血清dmem/f12培养液中加入ctgf（终浓度为20 μg/l）. 每组设3个复瓶，作用48 h后收集细胞.

　　1.2.2hk2细胞形态学观察加入各组试剂后，每6 h在倒置显微镜下观察细胞形态变化，48 h后倒置显微镜下照相.

　　1.2.3mtt法将hk2细胞制成悬液，按1×108/l接种于96孔板中，细胞分组同前，每组设6个复孔，刺激48 h后mtt比色法测定细胞增殖，以每孔a490 nm处吸光度（a）值表示.

　　1.2.4rtpcr加入ctgf 48 h后，按照trizol说明书在培养瓶中提取总的rna，经紫外分光光度计鉴定，取总rna2 μg作逆转录，试验步骤参照逆转录试剂盒说明书进行. 取1 μl逆转录产物为模板，进行pcr扩增反应. gapdh 反应参数如下：预变性94℃ 5 min,变性94℃ 30 s，退火54℃. e钙黏蛋白（ecadherin）和纤连蛋白（fibronectin，fn）退火59℃，αsma和胶原ⅰα退火63℃, 40 s，延伸72℃ 30 s，28个循环（ecadherin，fn，αsma和胶原ⅰα 32个循环）后，72℃延伸7 min. 取pcr产物5 μl在10 g/l琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统成像后，用图像分析处理系统进行灰度扫描，以密度代表其表达量. 用gapdh量校正，计算出ecadherin，αsma，fn和胶原ⅰα的相对表达量［3］. 重复3次独立的rtpcr全过程.

　　1.2.5免疫组织化学细胞爬片制作： 将hk2细胞制成悬液，按1×108/l接种于置有波片的6孔板中，培养条件、细胞分组和处理方法同前，48 h后收集波片. 免疫组化染色：波片冰丙酮固定, triton x100孵育，0.3 ml/l双氧水孵育，兔血清37℃封闭，加一抗，二抗，sabc液孵育，最后dab显色，苏木素复染，pbs代替一抗做阴性对照. 结果判定： 以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，采用捷达病理图像分析软件分析，各组细胞爬片随机取6个视野，分别测定其平均吸光度（a）值.

　　统计学处理： 所有数据由spss 11.0统计软件进行分析，计量数据以x±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，dunnet检验和非参数秩和检验. p<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1ctgf对hk2细胞形态的影响

　　倒置显微镜下观察结果显示，正常hk2 细胞为椭圆形贴壁细胞，培养液中加入ctgf（2.5 μg/l）48 h后，可见hk2细胞由椭圆形变为长梭形. 增加培养液中ctgf浓度（20 μg/l），细胞形态的梭形化更加明显.

　　2.2ctgf对hk2细胞增殖的影响

　　结果显示，每孔a490 nm处吸光度（a）值对照组为0.236±0.026；小剂量ctgf组为0.289±0.033；大剂量ctgf组为0.314±0.046. 与对照组比较结果显示，不同剂量ctgf均可促进细胞增殖（p<0.05）.

　　2.3ctgf对hk2细胞ecadherin和αsma mrna水平的影响

　　rtpcr结果显示，正常hk2细胞表达ecadherin，不表达αsma. ctgf（2.5, 20 μg/l）刺激48 h后，ecadherin mrna的表达较对照组下降（p<0.05），αsma mrna的表达较对照组提高（p<0.05，图1）.

　　2.4ctgf对hk2细胞fn和胶原ⅰαmrna水平的影响

　　rtpcr结果显示，正常hk2细胞少量表达fn和胶原ⅰα. ctgf（2.5, 20 μg/l）刺激48 h后，fn mrna的表达较对照组增加（p<0.05）. 小剂量ctgf组作用48 h后，胶原ⅰα mrna的表达较对照组无统计学意义（p>0.05）；大剂量ctgf组刺激48 h后，胶原ⅰα mrna的表达较对照组显著增加（p<0.05，图2）.

　　2.5ctgf对hk2细胞胞质fn和胶原ⅰ表达的影响

　　免疫组化结果显示，与对照组比较，小剂量的ctgf可以提高hk2细胞胞质fn的表达；增加ctgf的浓度，hk2细胞胞质fn的表达量增加更多（p<0.05）. 小剂量ctgf组作用48 h后，hk2细胞胞质胶原ⅰ的蛋白表达较对照组相比无统计学意义（p>0.05）；大剂量ctgf组刺激48 h后，hk2细胞胞质胶原 ⅰ 的蛋白表达较对照组增加（p<0.05，表2）. 表2ctgf对hk2细胞胞质fn和胶原ⅰ的表达(略）

　　3讨论

　　自strutz等［4］于1995年首先证实肾小管上皮细胞可以转化为间质细胞，以后称为emt，emt在肾间质纤维化中的作用日益受到人们的关注. 目前研究显示，有超过三分之一的肌成纤维细胞起源于肾小管上皮细胞［1］. emt主要包括四个关键步骤:上皮黏附特性消失，αsma表达和肌动蛋白重组，突破基底膜，细胞迁徙和侵袭增强［5］.

　　ecadherin是细胞间黏附蛋白，维持上皮细胞结构完整性和上皮极性，丧失ecadherin会引起上皮细胞间紧密连接消失，细胞失去极性. α sma 是平滑肌的标志蛋白,同时也是肌成纤维细胞的标志性蛋白,现被普遍用于检测肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的表型转化. 正常hk2 细胞表达ecadherin，不表达αsma. 肌成纤维细胞同时具有成纤维细胞和肌细胞的特性，表达αsma［6］. 我们的研究发现，ctgf能够使培养的正常hk2细胞发生形态学改变，细胞由椭圆变为长梭形，类似成纤维细胞形态. 提示细胞骨架构成发生改变. 研究也发现ctgf可以显著提高hk2细胞的增殖活性. rtpcr结果提示，对照组hk2细胞表达ecadherin，几乎不表达αsma. ctgf作用于正常hk2细胞，能够显著降低ecadherin mrna的表达，提高αsma mrna的表达. 这表明hk2细胞在ctgf作用下可能由上皮细胞表型向肌成纤维细胞表型发生转变.

　　细胞外基质在肾间质的过度沉积是引起肾间质纤维化的主要原因［7］. fn和ⅰ型胶原在间质的表达增多是肾间质纤维化的主要病理变化. ⅰ型胶原不仅作为ecm的重要组成部分，同时能够通过稳定间充质细胞的表型，进一步促进肾间质纤维化的发展. 本研究中我们发现，不同浓度的ctgf可以显著增加hk2细胞fn 基因的转录. 小剂量ctgf不能增加hk2细胞ⅰ型胶原基因的转录. 大剂量ctgf刺激hk2细胞，ⅰ型胶原基因的转录较对照组显著提高. 免疫组化结果也进一步证实ctgf可以提高hk2 细胞胞质fn蛋白的表达，大剂量ctgf能够增加hk2细胞胞质ⅰ型胶原蛋白的表达. qi等［8］在人近端小管上皮细胞，使用ctgf 20 μg/l刺激48 h，能够增加fn蛋白的表达，轻度增加ⅳ型胶原的表达. 张春等［9］的研究显示ctgf可以促进人近曲小管上皮细胞分泌fn. wang等［10］使用ctgf 1 μg/l刺激小鼠近端小管上皮细胞48 h，ⅰ型胶原的基因转录较对照组无显著变化. 这些研究与本实验结果相似. 我们研究发现ctgf 20 μg/l刺激hk2细胞48 h，可以增加ⅰ型胶原的表达，其与小剂量ctgf作用结果不同，考虑是由于ctgf剂量差异所致.

　　综上，ctgf可能通过诱导肾小管上皮细胞转分化，增加fn的合成，大剂量的ctgf可以增加其胶原ⅰ的合成，参与肾间质纤维化的发生发展. 因此阻断ctgf表达或者抑止其活性可能是更为有效的防治纤维化的手段.

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