激活K阿片受体与远程预处理诱导心肌缺血耐受的

【摘要】 目的：比较k阿片受体激动剂u50488h预处理与远程预处理诱导心肌缺血耐受对心肌梗塞（mi）范围与心肌酶的影响。方法：32只雄性新西兰大白兔随机分成四组（各组8例）：对照组、u50488h组、远程缺血预处理（rpc）组和选择性k阿片受体阻断剂（nor-bni）+u50488h组。对照组心肌缺血前1.5h静脉给予戊巴比妥钠30mg/kg；rpc组在心肌缺血前1.5h静脉给予戊巴比妥钠30mg/kg麻醉动物后，行双后肢短暂缺血预处理2次（充气式压力止血带环扎双后肢腘窝上1/3，压力26.6kpa，每次10min，间隔10min）；u50488h组在心肌缺血前105min静脉注射u50488h1.5mg/kg，余同rpc组；nor-bni+u50488h组在预处理前15min给予nor-bni 2mg/kg，余同u50488h组。各组最后制作急性心肌缺血模型：冠状动脉左前降支完全闭塞45min，松开结扎圈再灌注2h。依据美蓝、ttc组织染色，观察各实验组mi质量比、肌钙蛋白t、心肌酶的变化。结果：u50488h可模拟rpc对心肌的保护作用，较对照组明显减少心肌缺血-再灌注损伤所致的mi［（0.15±0.11）g∶（0.29±0.11）g］，肌钙蛋白t［冠脉阻闭45 min（3.86±1.19）ng/ml∶（9.16±2.82）ng/ml］，心肌酶的含量，p均<0.01。该作用可被选择性k阿片受体阻断剂nor-bni所阻断。结论：rpc诱导心肌缺血耐受与k阿片受体激活具有密切关系，激活k阿片受体是rpc诱导心肌缺血耐受的机制之一。

【关键词】 缺血预处理；心肌缺血；肌钙蛋白t

effect of activated k-opioid receptor and remote preconditioning on myocardium ischemia tolerancewang xin　lei yi　huang jiancheng　qian ruoyun　yang zhe　li shenyidepartment of anesthesiology, wurumqi general hospital, lanzhou military district, wurumqi, xnjiang,830000,chinaabstract：objective:to study the effects of u50488h (a selective kopioid receptor agonist) on the size of myocardial ischemicreperfusion and the plasma contents of myocardium enzyme compared with the protection of remote ischemic preconditioning from myocardial ischemia in s:a total of 32 male new zealand white rabbits were randomly divided into four groups: remote preconditioning group(rpc), ischemiareperfusion group(control),u50488h group and kopioid receptor blocking agent (nor-bni)+u50488h group detailed experimental protocols were as following: before left anterior descending coronary artery were occluded, animals in control group were anesthetized for 90min by pentobarbital sodium (sp) 30mg/g,while animals in rpc group were anesthetized with sp 30mg/g i.v and received both hindlimb ischemia preconditioning 2 times with obstructed by inflated blood pressure cuff keep on 200mmhg for 10min with 10min interval, then followed by 60min reperfusion；in u50488h group，all animals were injected u50488h 1.5mg/g before myocardial ischemia, then step as rpc (nor-bni)+u50488h group all animals were injected nor-bni 2mg/kg before myocardial ischmemia，then step as u50488h model of myocardial ischmemia was made in the end of each anterior descending coronary artery was completely occluded for 45min and followed by 2h reperfusion in all area on risk and the infarct size were determined by staining with methylene blue and triphenyl tetrazolium chloride(ttc) s:compared with control group,u50488h obviously decreased the infarct size［（0.29±0.11）g vs.（0.15±0.11）g］ and the content of serum troponin t［（9.16±2.82）ng/ml vs.（3.86±1.19）ng/ml］ (p<0.01 all) and myocardium enzyme caused by myocardial ischemia reperfusion injury(p<0.05 all), which can be blocked by k-opioid receptor blocking agent nor-bni(p<0.01,p<0.05).conclusion:the study showed that rpc pretreatment and u50488h can protect the myocardium from ischemia reperfusion injury,decreases myocardial infarction size and reduces myocardial enzyme leakage, lowers serum troponint concentration,k-opioid receptor agonism could be the one mechanism of rpc effect.

　　key words：ischemic preconditioning;myocardial ischemia;troponin t

　　缺血心肌再灌注时，由于氧自由基生成增加、酸中毒以及钙超载等因素，均可导致心肌缺血再灌注损伤。心肌缺血预处理则可产生心脏保护作用，但其不可操作性使不能被外科医师接受。远程预处理克服了心肌缺血预处理的不可操作性，为临床应用带来了希望，但其作用机制尚不完全清楚。目前已证实，心脏可自分泌或旁分泌内源性阿片肽，并通过作用于心肌上的阿片受体来调节心脏功能，在抗心肌缺血-再灌注损伤过程中发挥着十分重要的作用[1]。与心脏功能密切相关的阿片受体中k阿片受体占据着主导地位，在心肌缺血-再灌注损伤过程中发挥着直接或间接的保护作用，该作用与k受体激活后产生的负性肌力、负性频率、负性变传导以及激活后明显的扩血管作用有关[2]，我们推测k阿片受体激活极有可能是远程预处理诱导心肌缺血耐受的机制之一。因此，本实验拟以活体兔为实验对象，经双下肢缺血预处理诱导缺血耐受，通过结扎冠状动脉左前降支，建立急性心肌梗塞（ami）模型，利用k阿片受体激动剂u50488h对其进行研究，通过观察心肌缺血-再灌注损伤时对兔mi范围和血浆肌酸磷酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)和肌钙蛋白t（ctnt）的影响，探讨其对心肌保护的相关机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 分组及预处理模型

雄性新西兰大白兔32只，体重（2.5±0.4）kg，分为4组，每组8只：①对照组心肌缺血前90min经耳缘静脉给予戊巴比妥钠30 mg/kg-1；②缺血预处理组在心肌缺血前90min经耳缘静脉给予戊巴比妥钠30mg/kg，麻醉后行双后肢短暂缺血2次（充气式压力止血带环扎双后肢腘窝上1/3，压力26.6kpa，每次10min，间隔10min）；③u50488h组，在心肌缺血前105min静脉给予u50488h 1.5mg/kg,余同对照组；④nor-bni+u50488h组，在预处理前15min给予选择性k阿片受体阻断剂nor-bni（2mg/kg），余同u50488h组。实验中肛门留置温度计（509监护仪，美国），使用恒温箱控制体温在36.5～37.5℃，以排除温度对实验结果的影响。

　　1.2 心肌缺血模型

　　最后一次预处理后60min，依据fukuchi k等方法[3]制作心肌缺血模型：沿胸骨左侧第5肋间隙开胸(不破坏胸膜)靠近冠状动脉左前降支近端游离约1.0cm，5/0无创缝合线穿过动脉，套管法(图1，实验流程见图2)结扎45min，松开结扎圈2h，形成心肌缺血再灌注损伤模型。以左室前臂发绀及心电图st段抬高为模型成功标准。术中适时、按需追加麻醉药，常规吸氧，确保手术顺利进行且不抑制呼吸。

　　1.3 心肌肌钙蛋白t

分别于预处理前、冠脉阻闭前、冠脉阻闭后45min、缺血再灌注后1h、2h分别采集血液2.5 ml，以等量胶体溶液或3倍晶体液静脉注射，维持血流动力学稳定。所采集血液肝素抗凝，以4000r/min离心5min，取血清装入ependaf小管，低温保存，采用酶免疫测定化学发光法((elecsys 2010;roche, basel, switzerland)测定ctnt，可探测浓度为0.01ng/ml，大于0.1ng/ml表示有明显的心肌损伤。

　　1.4 心肌酶检测

分别于预处理前、冠脉阻闭前、冠脉阻闭后45min、缺血再灌注后1h、2h分别采集血液，静置后离心，分离血清进行检测。检测ck用速率法，ldh用免疫抑制法。 试剂为长征豪迈公司产品，在日立7150全自动系列生化分析仪上检测。所有操作均严格按照产品说明书进行。

　　1.5 心肌梗塞（mi）范围检测

心肌缺血再灌注2h后，戊巴比妥钠30mg/kg麻醉下，将2.0ml美蓝，直视下注入左心室，3min后用过量100g/l氯化钾处死动物，迅速摘除心脏，以0℃ 10g/l磷酸盐缓冲液（pbs）冲洗附着在心脏表面血迹，冰冻切片包埋（oct）液包埋心脏，-80℃冰箱速冻备用。沿心尖向基底部短轴连续切片，厚约5mm并观察切面颜色，随后放置在恒温37℃含10g/l氯化四唑（ttc）的10g/l pbs(ph=7.4)中孵育20min，行ttc染色，观察mi的范围。其中未发生心肌缺血的部分被美蓝染色，呈现蓝色；发生缺血但是未mi的区域被ttc染色，呈现红色；而mi的心肌部分不能被ttc染色，呈现出苍白色。在显微镜下，用刀片将实验动物左心室心肌各区分开，电子天平称重，计算左心室、缺血区质量，mi区与全心重量比以及mi区与心肌缺血区的重量比。

　　1.6 统计学方法

采用spss10.0统计软件包分析数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间均数比较采用方差分析，两组间比较采用最小显著差值法（lsd）检验。p<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 心肌肌钙蛋白t的变化

实验组和对照组术前肌钙蛋白t(ctnt)含量均少于0.20ng/ml，rpc、u50488h预处理组在冠脉阻闭后45min的ctnt（3.66±1.09）ng/ml，（3.86±1.19）ng/ml，显著低对于对照组（9.16±2.82）ng/ml(p<0.01),该趋势持续至本实验末期。各时间点两组比较亦具有明显的差异。对照组与u50488h组比较无显著差异。见表1。 表1 各实验组不同时间点肌钙蛋白t（ctnt）的变化　(略) 注: nor-bni：选择性k阿片受体阻断剂。与对照组比较△△p<0.01。下表同。

　　2.2 心肌梗塞范围的变化

取下心脏，剔除血管和脂肪等非心肌组织，生理盐水冲洗，洗净心腔积血，吸去水分，测量全心质量、心室质量。计算mi区心肌湿重占心室及全心湿质量的百分比。结果表明在给予心肌缺血45min，再灌注2h后，对照组出现明显的心肌缺血以及mi现象，而u50488h组与rpc组mi范围明显缩小(p<0.01)；但nor-bni+u50488h组与对照组比较无显著性差异(p>0.05)，见表2。表2 各组心梗塞（mi）百分比相关数据　(略)注：nor-bni+u50488h组与对照组比较无显著差异。
　
　　2.3 对ck和ldh水平的影响

　　rpc预处理组与u50488h组在冠脉阻闭后45min血浆ck和ldh 的含量远低于对照组水平(p<0.05)，nor-bni+u50488h组和对照组血浆中ck和ldh的 含量比较无显著差异(p>0.05)，见表3。表3 各实验组不同时间点心肌酶的变化(略)注：与对照组比较p<0.05。

3 讨 论

本研究表明k阿片受体激动剂u50488h能模拟rpc诱导的心肌保护效应，且其保护效应可被k阿片受体抑制剂nor-bni阻断，通过观察mi质量大小、心肌酶以及ctnt等指标差异的变化，表明激活k阿片受体是rpc诱导心肌缺血耐受的机制之一。

1986年，murry等[4]首先发现心肌反复短暂缺血可限制随后较长时间mi的范围，并能减缓atp衰竭的速率。缺血预处理(ischemic preconditioning，ipc)对心脏的保护作用可分为一个经典的，持续30min到2h急性期和急性期过后12～24h重新出现的延迟期，这一期有可能持续长达12h，因此提出了心肌缺血预适应的概念，即心肌能从短暂的缺血中产生内源性保护作用，对随后较长时间缺血具有保护作用。随后的研究表明，ipc是机体的一种内源性保护机制[5]，具有器官普遍性。1993年，przyklenk[6]等首次报道在狗的心脏缺血模型中，当给予一个血管区域缺血预处理后，可使远离该区域的心脏组织产生缺血耐受，这一发现，促使研究者思考ipc效应是否存在组织器官交叉保护现象？随后的研究结果支持这一假设。gho等[7]证实肾脏缺血预处理可诱导心脏缺血耐受，oxman等[8]发现给与大鼠下肢10min的短暂缺血，可对随后的心肌缺血产生保护作用，人们称此现象为远程预处理(remote preconditioning, rpc)：即给予远离缺血部位的组织或器官短暂缺血，可对缺血部位产生保护作用，诱导缺血耐受，为ipc的不可操作性和临床应用提供了新的思路。

我们立足于本实验结果，并结合既往的研究，对rpc和u50488h组在预处理效应中的作用和相互关系分析如下：既往我们利用双核素示踪放射自显影，显示出心交感神经损伤度远超过实际梗死灶。其机制可能为发生梗死导致区域性供血障碍，引起神经突触前结构损害，反射性激活交感神经末梢，血管持续痉挛，交感神经进一步损伤，神经末梢内atp大量耗竭。由于神经末梢对atp的依赖性远超过心肌细胞对atp的依赖，利用间位碘代苄胍（mibg）显影就出现区域性结构改变，从而使交感神经颗粒超微结构的损害程度明显比心肌细胞损害程度重，表明rpc对缺血心肌的保护作用与抑制交感神经的损伤具有密切关系[9]。另外，我们通过手术研究发现，rpc介导的下肢缺血再灌注损伤所诱导的缺血耐受，对缺血心肌具有保护作用[10]，这是通过减少心肌肌钙蛋白和心肌酶系的释放而体现。由于激活k阿片受体可产生明显的负性肌力、负性频率和负性传导作用，并且具有明确的扩血管作用，我们推测这与抑制交感神经的损伤具有密切的关系。本研究结果表明，心肌缺血同时给予k阿片受体选择性激动剂u50488h可通过激活k阿片受体产生缺血-再灌注损伤保护作用，这种保护作用与rpc产生的保护作用相似，而在预处理前给予给予k阿片受体特异性阻断剂nor-bni后，其对缺血心肌的保护作用消失，表现为缺血、梗死质量的差异，心肌酶及ctnt水平的变化。这一结果强烈提示k阿片受体激活在心肌缺血-再灌注过程中对心肌缺血具有的保护作用，是rpc诱导心肌缺血耐受的机制之一。

ck及ck-mb是目前早期诊断心肌缺血和损伤程度及评价预后的敏感性指标，其升高的程度与心肌损伤的程度正相关。监测心肌酶谱的变化对判断心肌缺血性损伤程度以及评价心肌保护作用具有重要意义[11,12]。ctnt是唯一特异存在于心肌细胞中的一种小分子单链多肽物质，与其他组织无交叉抗原性，对心肌细胞缺血、缺氧、变性、坏死等具有高度特异性，是目前最具有特异性的心肌标志物之一，灵敏度和特异度优于其它酶，能准确评估心肌损伤程度，可用于心肌损伤和保护效果的判断[13]。美国心脏病学会关于非st段升高ami患者处理的修正指南中，ctn检测已被用作心梗诊断和预测的基本标准之一[14]。因此对心肌损伤时相关的心肌酶活性及ctnt的测定,对判断心肌损伤程度和评估预后具有重要的指导意义[15]。

本研究还发现：预先给予u50488h处理后，血浆中ck和ldh的含量和心肌损伤的标志物ctnt较对照组明显降低，提示预先给予u50488h能有效地减轻心肌细胞损害，从另一角度说明激活k阿片受体是rpc发挥心肌保护作用的机制之一。

【参考文献】
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　　［4］murry ce, jennings rb, reimer ditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［j］.circulation,1986,74:1124-1136.

　　［5］yellow dm, downney ditioning the myocardium: from cellular physiology to clinical cardiology［j］.physiol rev,2003,83:1113-1151.

　　［6］przyklenk k, bauer b, ovize m, et al ischemic preconditioning protects remote virgin myocardium from subsequent sustained coronary occlusion［j］.circulation, 1993,87:893-899.

　　［7］gho bcg, schoemaker rg, van den doel ma, et dial protection by brief ischemia in noncardiac tissue［j］.circulation, 1996,94:2193-2200.

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　　［9］雷 毅，张龙芳，周 谊,等.后肢远程预处理对心肌缺血再灌注与心交感神经损伤的影响［j］.心血管康复医学杂志,2009,18(1):1-5.