直肠癌患者外周血单核细胞诱导为树突细胞

【关键词】 直肠癌;单核细胞;树突细胞;免疫治疗

【摘要】 目的 用直肠癌患者外周血单核细胞通过体外培养的方法诱导为成熟树突细胞。方法 cs3000血细胞分离机采集直肠癌患者外周血单核细胞悬液，ficoll分离单个核细胞，用含10%fbs的rpmi1640培养基培养，第0天加入gmcsf 1 000 u/ml、il4 500 u/ml，第4天2/3量换液，补足gmcsf、白介素(il)4，并加入肿瘤坏死因子(tnf)α 500 u/ml诱导其成熟，以后每隔3天2/3量换液。结果 培养至第11天，收集培养的1×105～2×105个树突细胞经流式细胞仪检测表达cd83+(52.9±5.8)%，cd86+(79.2±8.1)%，hladr (65.8±5.7)%，cd1a(51.3±6.4)%，及cd+14(4.72±2.16)%。结论 直肠癌患者外周血单核细胞经gmcsf、il4及tnfα联合培养能诱导出成熟树突细胞。为直肠癌的免疫治疗提供了临床应用基础。

【关键词】 直肠癌;单核细胞;树突细胞;免疫治疗

　【abstract】 objective to induce the peripheral blood mononuclear cells (pbmcs) from rectal cancer patients into dendritic cells in vitro. methods pbmcs of patients with rectal cancer were collected by cell detachment machine, abstracted by ficoll, cultured in rpmi1640 nutritive medium containing 10% fbs, induced by adding gmcsf 1 000 u/ml, il4 500 u/ml on the 1st day, and 2/3 volume of fluid was exchanged, gmcsf and il4 were complimented and tnfα 500 u/ml was joined to promote mature on the 4th day, and thereafter 2/3 volume of exchange fluid every 3 days. results 1×105～2×105 dendritic cells were collected and detected. the expression of cd83+ was(52.9±5.8)%，cd86+ was(79.2±8.1)%，hladr was(65.8±5.7)%，cd1a was(51.3±6.4)%，and cd14+ was(4.72±2.16)%. conclusions pbmcs from rectal cancer patients can induced into dendritic cells by gmcsf, il4 and tnfα, and which provide the clinical application basis for cell immunotherapy of rectal cancer.

　　【key words】 rectal cancer; pbmc; dendritic cell; immunotherapy

　　直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于胃癌和食道癌，是大肠癌的最常见部位。直肠癌的治疗通常采用直肠系膜的整体切除结合放射治疗，但是复发率高，严重影响患者的生活质量。近年来随着肿瘤免疫学和细胞生物学的发展，以树突细胞(dc)为基础的抗肿瘤免疫治疗成为当前直肠癌治疗研究的热点〔1〕。dc是体内功能最强的抗原提呈细胞(apc)，是启动、调控、维持免疫应答的中心环节，在诱导特异性抗肿瘤细胞免疫中起着关键作用。本研究通过对直肠癌患者外周血单核细胞通过加入多种细胞因子诱导培养为成熟dc，为直肠癌的生物免疫治疗提供临床基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要实验材料

　　淋巴细胞分离液(天津川页公司)，rpmi1640培养基(美国gibco公司)，胎牛血清(fbs，天津灏洋公司)，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhgmcsf，厦门特宝公司)，重组人白细胞介素4(rhil4)，肿瘤坏死因子α(tnfα，上海欣百诺公司)，流式细胞仪(美国becton dickinson公司)，cs3000血细胞分离机(美国百特公司)，co2培养箱(美国shellab)。

　　1.2 实验样本

　　通过cs3000血细胞分离机采集直肠癌患者3 000 ml循环量的外周血单核细胞悬液约60 ml左右。

　　1.3 实验方法

　　取收集的单核细胞悬液用含15 u/ml肝素的生理盐水稀释，2 500 r/min离心15 min，去上清，沉淀用生理盐水1∶6稀释，200目筛网过滤，将稀释液小心平铺到淋巴细胞分离液上层。2 000 r/min离心20 min，吸取单核细胞层，生理盐水洗涤3次，去上清，以 rpmi1640培养基重悬，200目筛网过滤，平分至6个75 cm2的培养瓶中，37℃、5% co2培养箱中贴壁30 min，轻轻晃动培养瓶，吸除悬浮细胞，生理盐水轻轻洗涤1次，加入含gmcsf 1 000 u/ml、il4 500 u/ml、10%fbs的rpmi1640培养基25 ml，继续培养，并记为第0天，第4天2/3量换液，补足gmcsf、il4，并加入tnfα 500 u/ml，诱导dc成熟，以后每隔3 d 2/3量换液，补足细胞因子。培养至第11天，用细胞刮刀轻轻刮下贴壁细胞，生理盐水1 000 r/min离心10 min，洗涤3次，取1×105～2×105个细胞进行细胞表型检测。

　　2 结 果

　　2.1 倒置生物显微镜对dc生长情况进行形态学观察

　　刚加培养基时细胞圆形，颜色较暗，均贴壁，单个散在密布于瓶底。培养2～3 d后，细胞出现变形，有少量梭形细胞出现，并有部分细胞悬浮，贴壁细胞有聚集成团现象。加入tnfα后，细胞变形速度加快，细胞体积明显变大，颜色变亮。绝大多数细胞核增大，细胞膜膨隆，伸出伪足，具有典型树突状形态，低倍镜下观察细胞相互交织成网状。用细胞刮刀刮过后，可见一层灰白膜状物质被刮下，镜下观察细胞伪足消失，细胞体积大，呈圆形。

　　2.2 细胞表型检测

　　培养第11天，每个培养瓶可收集1×107～1.5×107个dc，经流式细胞仪检测表达cd+83(52.9±5.8)%，cd+86(79.2±8.1)%，人类白细胞抗原dr位点(hladr)(65.8±5.7)%，cd1a(51.3±6.4)%，cd+14的阳性表达率较低，其表达率为(4.72±2.16)%，表明外周血单核细胞可以诱导为成熟dc细胞。

　　3 讨 论

　　dc是美国学者steiman于1973年所发现，因其成熟细胞具有许多树突样或伪足样突起而得名〔2〕。研究发现，dc是功能最强的apc，作为机体免疫应答的启动者，在免疫系统中占有独特的地位，对肿瘤免疫的产生及调控具有重要作用。dc主要有两个生物学亚群〔3，4〕，即髓样dc和淋巴样dc，其前体细胞由骨髓产生，进入外周血分布到全身各组织，可分为未成熟和成熟两种分化形态。未成熟dc在光镜下呈星形，其表面表达高水平的与抗原摄取有关的分子，如fcγr、fcεr和甘露醇受体等，具有强大的捕获、加工、处理抗原的能力。随着dc在组织间迁移并分化成熟，逐渐向周围淋巴器官归巢，形态由星形转变为无规则的树突状，高表达组织相溶性复合物(mhc)ⅰ、ⅱ类分子、共刺激分子、黏附分子等，同时摄取、处理、完整蛋白抗原的能力下调，并获得递呈抗原及活化t细胞的能力。

　　dc广泛存在于全身各组织，但数量较少，仅占外周血单核细胞总数的0.5%～1%，难以分离与纯化，限制了其在临床上的广泛应用。近年来，随着对dc研究的不断深入，以外周血单个核细胞诱导为dc的培养技术日益成熟，目前gmcsf、il4及tnfα的联合应用成为dc培养的基本方案。其中gmcsf可促进髓系细胞发育，是生成和维持dc发育和分化的最根本的细胞因子;il4可抑制粒细胞和巨噬细胞产生，促进单核细胞向dc的转化，并维持dc成熟;tnfα可阻止粒系的分化而刺激dc的成熟并增强抗原递呈能力〔4，5〕。体外通过单核细胞诱导培养获得的dc与纯化的体内成熟dc 具有相同的抗原提呈功能，为肿瘤的免疫治疗提供了临床应用基础。

　　免疫反应的产生首先由apc捕获抗原，加工处理后将抗原信息传递给t、b细胞，从而引发一系列的免疫应答。因此，apc是机体免疫反应的首要环节，能否进行有效的抗原提呈关系到免疫激活和免疫耐受的诱导。dc的最大特点是能够激活初始型t细胞增殖并建立初级免疫应答，在肿瘤免疫的产生和调节中发挥关键作用。近年来，随着对dc在肿瘤免疫研究中的不断深入，以dc为基础的肿瘤疫苗研究已在黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肾癌等的研究中取得了令人鼓舞的结果，dc在肿瘤治疗领域的应用有着广阔的应用前景〔4〕。timmerman等〔6〕应用独特型抗体刺激致敏的自体dc过继回输治疗初发的非霍奇金b淋巴瘤病人，病人均产生特异性抗肿瘤免疫应答，未见副作用。表明dc疫苗已显示良好的抗肿瘤效应。

　　经过研究者的不断探索，以dc为疫苗治疗直肠癌已经取得了较为显著的成果。burgdorf等〔7〕用肿瘤细胞裂解物反复冲击经直肠癌患者的外周血单核细胞诱导的dc，制成dc疫苗，在对17例直肠癌患者的治疗中病情稳定率达24%(4/17)，且安全、无毒副反应。本研究通过cs3000血细胞分离机分离外周血单核细胞，在75 cm2培养瓶中每瓶可诱导出1～1.5×107个树突细胞可用于直肠癌的免疫治疗。随着研究的不断深入，以dc为基础的肿瘤免疫治疗方法可能会成为直肠癌治疗领域的一个新的发展方向。

【参考文献】
　1 李 响，刘朋飞，朱 磊，等.树突细胞在直肠癌免疫治疗中的研究进展〔j〕.中国老年学杂志，2009;29(22)：298890.

　　2 龚非力.医学免疫学〔m〕.北京：科学出版社，2003：117.

　　3 匡志鹏，梁安民.cik细胞和dc的免疫生物学特性及抗肿瘤研究进展〔j〕.广西医科大学学报，2006;23(2)：33841.

　　4 俞志勇，陈 虎，冯 凯.树突状细胞肿瘤疫苗的制备及临床应用面临的问题〔j〕.中国实验血液学杂志，2004;12(3)：397400.

　　5 陈宝安，李 曼，孙载阳.树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对耐药k562细胞的体外杀伤作用〔j〕.中华血液学杂志，2005;26(6)：3558.

　　6 timmerman jm，czerwinski dk，davis ta,et pepulsed dendritic cell vaccination for bcell lymphoma:clinical and immune responses in 35 patients〔j〕.blood，2002;99(5):151726.

　　7 burgdorf sk，fischer a，myschetzky ps,et al responses in patients with advanced colorectal cancer to a dendritic cell based vaccine〔j〕.oncol rep，2008;20(6):130511.