大鼠原位肝移植动物模型成功建立的技巧
【关键词】 肝移植;大鼠;模型，动物;改良二套管法
technical improvement for the successful establishment of model of orthotopic liver transplantation in ratschen zhihong*， qian haixin， qin lei， et al. * department of genery surgery， the first affiliated people’s hospital of jiangsu university， zhenjiang 212002abstract objective to probe into the technique for successful establishment of the model of orthotopic liver transplantation in rats. methods orthotopic liver transplantation was conducted in 130 pairs of sd rats with modified two-cuffed technique. the first 40 pairs were the pre-experimental group， the middle 60 pairs were the experimentally skilled group， and the last 30 pairs were the experimentally consummate group. operation technique was summarized and the successful operative rate， the postoperative survival rate and the operative complications were observed. results the successful operative rate and the 7 day survival rate were 27.5% and 0 respectively for the pre-experimental group， 75.0% and 40.0% for the experimentally skilled group and 93.3% and 86.7% for the experimentally consummate group. conclusion the skilled surgical operative technique is the key to successful operations. shortening the anhepatic period， taking all measures to prevent operative accidents and ensuring consummate operative details may be effective promise for long-term postoperative survival.
key words liver transplantation; rats; models， animal; modified two-cuffed technique
目前大鼠原位肝移植手术(rat orthotopic liver transplantation，rolt)日渐成熟，各地报道也很多。但对每一位新手来说，大鼠原位肝移植仍然是非常困难的。我们采用“改良二套管法”对130对大鼠进行原位肝移植手术。我们发现，缩短无肝期时间、采用各种措施来杜绝手术意外以及完善的手术细节是术后长期生存的有效保障。现将大鼠原位肝移植动物模型成功建立的关键技巧报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物及材料 健康雄性sd大鼠共260只，体质量200～250 g，受体体质量略重于供体。供体术前禁食4 h，自由饮水。受体手术前12 h禁食，自由饮用糖盐水。sd大鼠均由苏州大学动物实验中心提供。显微手术器械一套，双极电凝来自上海沪通gd350-s3。自制器械：门静脉袖套管，内径为1.70 mm，外径为1.94 mm，长3.0 mm;肝下下腔静脉袖套管，内径为2.50 mm，外径为2.75 mm，长3.0 mm;胆总管袖套管，为小儿硬膜外导管长4.0 mm。麻醉药品：氯胺酮(100 mg/2 ml)。供体肝脏灌注液：4 ℃乳酸钠林格氏液500 ml中加入肝素钠12 500 iu制成。供体肝脏保存液：4 ℃乳酸钠林格氏液。受体肝脏驱血液：贺斯。
1.2 实验方法
1.2.1 供体手术。供体采用氯胺酮麻醉，100 mg/kg，腹腔注射。取腹部肋缘下弧型切口，进腹后，将肠管推向左下腹，生理盐水纱布裹覆。游离肝下下腔静脉直至左肾静脉开口水平，分别电凝切断腰静脉、右肾上腺静脉。游离右侧肾动脉、右肾静脉。分离胆总管，在肝管汇合部远端约5.0 mm处剪开胆总管前壁，向近端插入胆总管插管，1号丝线结扎固定。于插管处远端剪断胆总管。游离门静脉，分离开肝固有动脉与门静脉之间的组织。分离幽门静脉，贴近门静脉处用6-0 prolene线结扎幽门静脉，线结尽可能留短。游离部分腹主动脉，用小儿细静脉留置针穿刺，1号线固定。迅速剪开膈肌，血管钳阻断胸主动脉。4 ℃供体肝脏灌注液持续灌注肝脏，流速控制在2～3 ml/min。经胸腔剪开肝上下腔静脉，平右肾静脉开口下缘剪断肝下下腔静脉，灌注液顺利流出。分离切断肝周韧带。推肝脏向下使膈肌与肝脏之间的下腔静脉壁形成轻微的张力，贴膈肌环剪断下腔静脉。电灼离断肝与食管的血管支。均匀灌注肝脏至完全苍白，约需2～3 min，电凝后切断肝动脉，在脾静脉的水平剪断门静脉，在线结的远侧剪断幽门静脉，取出供肝。置入0～4℃乳酸钠林格氏液中。
1.2.2 修肝。修剪掉肝上下腔静脉壁上的毛刺，保留肝上下腔静脉前壁2 mm、后壁1 mm。仔细剥离门静脉壁上的脂肪组织。用微血管镊穿过自制袖套管管腔，夹住门静脉远端壁后，袖套管滑下，门静脉远端壁外翻于套管壁外，以幽门静脉的结扎线结刚好外翻于套管壁外为佳，6-0 prolene线在袖套管烙痕内结扎固定门静脉外翻壁。同法处理肝下下腔静脉。在肝上下腔静脉两角用6-0 prolene带针线各缝合一针备作为两点式缝合的支持线。
1.2.3 受体手术。采用氯胺酮腹腔注射麻醉，80 mg/kg。肋缘下弧型切口，将肠管推向左下方，生理盐水纱布裹覆。在右肾静脉上缘平面游离肝下下腔静脉，电凝切断腰静脉、右肾上腺静脉。游离肝周韧带，电凝切断左膈静脉，充分游离肝上下腔静脉。电凝切断左肝至食管血管。游离胆总管，在分叉处切断，将远端胆总管翻向下方。游离结扎切断肝固有动脉。在幽门静脉水平上方游离门静脉。用微血管夹阻断肝下下腔静脉、门静脉，门静脉夹尽量远离肝脏，无肝期计时。在门静脉分叉处穿刺，缓慢注入(1.0～1.5 min)37 ℃驱血液2.5～3.5 ml。用satinsky钳钳夹膈肌环阻断肝上下腔静脉，以膈肌环刚好外露在钳下缘为好。近肝切断肝上下腔静脉、门静脉和肝下下腔静脉，移去原肝。将供肝从4 ℃的保存液中取出，原位放入肝脏腔隙内。将供肝右角6-0 prolene线与受者肝上下腔静脉右侧角腔外缝合，打结并牵引。将供肝左角6-0 prolene线与受者肝上下腔静脉左侧角腔外缝合，打结，单线牵引。自左向右连续缝合腔静脉后壁，“u”字缝合右角后再作腔静脉前壁连续缝合至左侧角。肝素化生理盐水冲洗血管腔排出气泡，缝合线与右角的牵引单线打结，肝上下腔静脉缝合完成。冲洗受者门静脉断口内的血凝块，迅速套入供者门静脉袖套管，在袖套管烙痕内用1号丝线结扎。移去门静脉微血管夹及肝上下腔静脉satinsky钳，供肝恢复血流，结束无肝期。供肝肝下下腔静脉见血后，微血管夹夹闭供肝肝下下腔静脉。将受者肝下下腔静脉微血管夹下移至右肾静脉处，肝素生理盐水冲洗掉血凝块，迅速插入供肝下腔静脉袖套管，1号丝线烙痕内结扎固定。大量40 ℃复温液冲洗供肝和腹腔复温。将胆总管支架管插入受者胆总管内，1号丝线结扎固定，大网膜覆盖供肝胆总管，固定。拭尽腹腔内40 ℃复温液。滴两滴庆大霉素于腹腔内及皮下。用1号丝线关腹。
1.2.4 术后处理。手术结束后，酌情从阴茎背静脉补液2～3 ml。将大鼠放置在电热台板上复温30 min并持续吸氧。完全清醒后单笼喂养，自由进糖盐水，自由进食。
2006年6月至2006年9月间共完成130例大鼠原位肝移植动物模型制作手术，第一阶段40例我们主要是摸索手术步骤，称为预试验组;第二阶段60例我们主要是熟练手术步骤，总结手术过程中不足甚至是失败的经验教训，称为实验熟练组。第三阶段30例完善了手术的每一步骤，基本上杜绝了手术意外，保证每一例都有一较短的无肝期时间，此阶段30例为实验完善组。该手术流程步骤按照实验完善组所确定。术后存活24 h视为手术成功。术后不能存活7 d的大鼠均尸检打开胸腹腔，了解死亡的原因。
1.3 统计学方法 采用sas6.12统计软件进行数据分析。所有数据均以均数±标准误表示。两组样本均数间比较用完全随机设计资料的方差分析，两组间率的比较采用卡方检验。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
“改良二套管法”大鼠原位肝移植动物模型建立不同阶段手术时间的比较 见表1。
“改良二套管法”大鼠原位肝移植动物模型手术成功率及7 d生存率 见表2，表3。
“改良二套管法”大鼠原位肝移植动物模型建立手术失败的原因 见表4。
3 讨论
大鼠原位肝脏移植是肝脏移植研究中应用最广泛、最有价值的动物模型。kamada等[1]于1979年提出了套管法吻合门静脉，从而保证无肝期一般可控制在25 min以内。1983年kamada等[2]进一步将肝下下腔静脉亦采用袖套法吻合，从而缩短了受体手术时间，进一步提高了存活率。本实验以经典的二套管法(kamada法)作为大鼠原位肝脏移植基本手术方法。第一阶段是摸索和逐步熟悉手术步骤阶段。在第二阶段，我们稳定了手术方案，熟练掌握手术的每一步骤，总结手术过程中不足甚至失败的经验教训。第三阶段30例我们完善了手术的每一步骤，从表1、表2、表3和表4中我们可以看出，此阶段平均无肝期时间是(14.27±1.98)min，基本上杜绝了手术意外，结果获得93.3%的手术成功率和86.7%的7 d生存率。现在把在经典的二套管法(kamada法)的基础上所做的有效技巧改进点介绍如下。
3.1 套管的制作 我们自制的门静脉袖套管长3.0 mm，管外壁一端烫有浅槽以利于结扎固定。袖套管如果太长会压迫到门静脉左右分支，影响入肝血流，袖套管如果太短，会造成门静脉管壁外翻于套管外时套管固定困难和供、受体门静脉套接时供体门静脉管壁太长、活动度太大所造成的套接后供体门静脉扭转;肝下下腔静脉袖套管长3.0 mm，管外壁一端也烫有浅槽以利于结扎固定;胆总管袖套管，为小儿硬膜外导管，长4.0 mm，管子的两端剪成斜坡状，这样便于插入胆道。
3.2 麻醉 我们采用氯胺酮腹腔注射麻醉，供体100 mg/kg，受体80 mg/kg[3]。我们在预试验阶段有2只麻醉后就死亡，考虑可能是误注入血管内、个体差异或者是麻醉药过敏所致。还有一只在术毕因麻醉过深而未醒而死。因此在使用氯胺酮腹腔注射麻醉时采用宁少勿多，术中酌情补足的原则，根据大鼠的体质、精神状况、反应能力等酌情增减开始的剂量。
3.3 供肝的保护 在供体手术中以尽量不接触肝脏为原则，具体表现在，入腹腔后只能以棉签、盐水纱布帮助暴露手术野;分离肝下下腔静脉周围的脂肪和结缔组织时，以牺牲右肾，保护肝脏为原则，推移右肾，不接触肝脏来达到暴露。
3.4 幽门静脉的处理 幽门静脉在近段游离后，6-0 prolene线紧靠门静脉结扎，线结要留得小，这样的好处是：线结及幽门静脉残端小，易于门静脉套管时外翻静脉血管壁，同时线结也起了门静脉刚好外翻套管外的可靠标志。
3.5 经腹主动脉灌注供肝 采用腹主动脉插管、钳夹胸腔降主动脉的经肝动脉、门静脉的“双灌注法”，4 ℃灌注液部分经肝动脉入肝，部分通过腹腔脏器回流后经门静脉入肝，收到肝动脉及门静脉双重灌注的效果，使肝脏的热缺血时间降至最低，减少了热缺血损伤。而且一旦出现插管失败还可以退而行门静脉插管灌注。灌注供肝前应还原肝脏各叶的位置，理顺胃肠道，避免门静脉系统和肝静脉及其属支扭转受阻，影响灌注质量。灌注的压力和速度要控制，以40 cm左右的静水压均匀灌注，且供体在手术前无需肝素化，即可获取色泽均匀、质地柔软的供肝。
3.6 切断肝上下腔静脉和门静脉 我们对切断肝上下腔静脉采用了一个科学合理的方法，推肝脏向下使膈肌与肝脏之间的下腔静脉壁形成轻微的张力，这样使下腔静脉处于自然、均匀扩张状态下，很容易由一侧剪开并沿膈肌环剪下下腔静脉，避免了在修肝时，下腔静脉塌瘪而造成的修剪困难和下腔静脉意外损伤，同时也节省了修肝时间。门静脉切断的位置，我们的经验是正好在脾静脉的水平，使门静脉有一较大的外口，有利于套管时门静脉的外翻。
3.7 修肝的技巧 整个修肝过程均应在0～4 ℃保存液中进行。我们只要修剪掉肝上下腔静脉壁上的毛刺，就能保留肝上下腔静脉前壁2 mm、后壁1 mm。修剪后要注意检查静脉壁是否有破口，尤其是左隔下静脉的汇入口，我们一般用6-0 prolene带针线跨过汇入口缝扎作为支持线;肝门部的修整要注意勿过多地破坏胆道的血供;门静脉套管时最好以幽门静脉的结扎线结刚好外翻于套管壁外为佳，以免结扎线结影响门静脉的血流。门静脉管细且壁薄有时外翻困难，因此手术者和助手要集中精力一气呵成，避免多次操作撕裂菲薄的静脉壁造成门静脉短缺。
3.8 受体肝脏的切除 受体自身肝分离时要求操作细致，止血严密，减少不必要的失血失液，尤其分离肝上下腔静脉时，任何小的失误如伤及静脉壁与膈肌，均可导致整个手术的失败。我们选用羟乙基淀粉(商品名：贺斯)作为驱血液，将受体肝脏内的血驱入腔静脉系统，即所谓的“自体输血”。一般驱血2.5～3.5 ml，时间1.0～1.5 min，这时肝脏变成灰白色。驱血时的针刺点须注意，太靠近肝门部，驱血液进入门静脉左支或右支，造成驱血不均，太远离肝门部，则门静脉套管后出现针眼漏血，我们是选在门静脉左、右支交汇处;切除受体肝脏时，要尽量多保留受体肝下下腔静脉甚至连带少部分肝组织，钝性剥除掉附带的肝组织后，以获得较长的受体侧肝下下腔静脉。切断受体肝上下腔静脉：在用satinsky钳钳夹受体肝脏下腔静脉时，既要保证切断后有足够长的下腔静脉，以利于供、受体的吻合，又要注意勿过度钳夹牵拉膈肌引起大鼠呼吸抑制。我们是沿膈肌边缘上钳，以膈肌环刚好露出钳下缘为好。
3.9 肝上下腔静脉的吻合 由于肝上下腔静脉壁极薄，容易撕裂，所以操作时一定要轻柔。采用内膜对内膜的连续缝合，尤其在受体血管壁外带有肝脏组织时，这样吻合可以完全将血管外的肝脏组织吻合在血管腔外。吻合时针距和边距应适当，均在0.8 mm左右，以防漏血。
3.10 门静脉、下腔静脉和胆总管的套接 门静脉和下腔静脉套接前确保供肝静脉套管位置放正，无扭转，然后固定这方向进行套接，这样套接后可避免静脉扭曲、成角。胆总管套接时内支架管的直径应比胆总管直径略大，内支架不可插至左右肝管汇合处，而且供受体胆管断端一定要拉拢，不能扭曲，以免引起胆道阻塞。胆总管套接后用大网膜覆盖供肝胆总管，避免日后胆总管坏死。
3.11 肝动脉重建 理论上不吻合肝动脉会导致供肝的胆总管黏膜缺血，但是在本实验中，我们对死亡大鼠均进行解剖，未发现因胆道缺血致死的，故在不影响受体大鼠观察期内生存率的前提下，我们选择简化的不吻合肝动脉的模型。
【参考文献】
[1] kamada n， calne ry. orthotopic liver transplantation in the rat[j]. transplantation，1979，28(1)：47-50.
[2] kamada n， calne ry. a surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat[j]. surgery，1983，93(1)：64-69.
[3] 余斌，秦磊，钱海鑫. 大鼠肝移植的麻醉[j]. 苏州大学学报(医学版)，2005，25(2)：245-247.