IL-6 mRNA在进展期结直肠癌低蛋白血症组织中的表

【摘要】 目的 研究白细胞介素6(interleukin-6,il-6)与进展期结直肠癌低蛋白血症的关系。方法 根据入院第二天用溴甲酚绿法(bromcresol green，bcg)测量空腹血白蛋白(albumin，alb)的浓度，将标本分为两组:低蛋白血症组(alb<35 g/l)及非低蛋白血症组(alb≥35 g/l)，应用rt-pcr半定量的方法检测il-6 mrna在低蛋白血症组以及非低蛋白血症组中的表达。结果 il-6 mrna在低蛋白血症组癌组织中的阳性表达率较非低蛋白血症组癌组织中的阳性高（p=0.000），在两组相应的正常黏膜组织标本中均不表达。结论 il-6通过影响机体对白蛋白的摄入、排出及代谢，在进展期结直肠癌低蛋白血症的发生、发展中起到重要作用。

【关键词】 白细胞介素6; 低蛋白血症; 进展期结直肠癌; rt-pcr半定量法

expression and significance of interleukin-6 mrna in tumor tissues of advanced colorectal cancer associated with hypoalbuminaemia

chenlisheng,zhuxijia. department of colorectal surgery, the first affiliated hospital of guangxi medical university, nanning 530021,china

［abstract］ objective to study the relationship between the interleukin-6 and the advanced colorectal cancer associated with s according to the concentration of empty stomach blood albumin(detected by bcg method at the second day in hospital),the patients were divided into hypoalbuminaemia group (albumin＜35 g/l) and nonhypoalbuminaemia group(albumin≥35g/l). rt-pcr semi-quantity method was used to detect the expression of il-6 mrna in the two groups. results the expression of il-6 mrna in hypoalbuminaemia group was significantly higher than that in nonhypoalbuminaemia group(p=0.000), but was not expressed in the paired normal tissues of the both two groups. conclusion it suggests that il-6 plays an important role in the genesis and development of hypoalbuminaemia in patient with advanced colorectal cancer.

［key words］ interleukin-6; hypoalbuminaemia; advanced colorectal cancer; rt-pcr semi-quantity method

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，患者就诊时80%已是进展期［1］，常合并有低蛋白血症。低蛋白血症是导致结直肠癌患者发生术后并发症以及预后不良的主要原因之一［2,3］，但导致进展期结直肠癌患者发生低蛋白血症的因素仍然不甚明确，目前认为与肿瘤本身所致负氮平衡以及肿瘤产生的物质作用于机体所导致的代谢异常有关［4］。近年已有大量研究报道了细胞因子在结直肠癌患者中的作用，其中有很多涉及il-6［5］,而il-6与结直肠癌低蛋白血症的关系目前尚未见报道。本研究采用rt-pcr半定量的方法检测il-6 mrna在进展期结直肠癌患者肿瘤组织及其相应的正常黏膜组织中的表达，从分子生物学水平分析il-6与进展期结直肠癌低蛋白血症的关系，探讨结直肠癌低蛋白血症的发生机制，为结直肠癌低蛋白血症的治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 入选及分组 入选的病例均为原发性结直肠癌患者，除外并有感染性疾病及肝肾功能异常者。根据入院第二天用溴甲酚绿法测量空腹血清白蛋白(albumin，alb)值，将研究对象分为低蛋白血症组(alb<35 g/l,38例)及非低蛋白血症组(alb≥35 g/l,25例)两组。研究的63例结直肠癌患者中，男39例，女24例，年龄25～77岁。

1.2 标本来源 取自2006年9月至2006年12月间，在广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科住院的上述低蛋白血症组(38例)及非低蛋白血症组(25例)实施手术治疗的结直肠癌病例肿瘤组织及其相应的正常黏膜组织(离癌灶10 cm以上)标本。所有病例均经过病理确诊，根据dukes分期标准分为b、c、d期，术后病理提示切缘无癌细胞浸润。收集的肿瘤组织及其相应的正常黏膜组织离体后迅速投入液氮冷冻，然后转移至－80℃超低温冰箱中保存备用。

1.3 引物 根据已知的 il-6 mrna 序列设计并合成一对扩增引物，pcr扩增产物260bp, il-6上游引物:5’-tcaatgaggagacttgcctg-3’，il-6下游引物:5’-gatgagttgtcatgtcctgc-3’。选用gapdh作内参照，pcr扩增产物439 bp,gapdh上游引物:5’-tcattgacctcaactacatg-3’，gapdh下游引物:5’-gcagtgatggcatggactgt-3’。以上引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.4 mrna的提取及逆转录合成cdna的操做均严格按照试剂盒说明书进行。

1.5 il-6 pcr扩增:扩增体系(总体积为25 μl) 10×buffer(mg2+free) 2.5μl,dntp 2 μl,mgcl2(25 mm) 1.5 μl,模版1.5 μl，上下游引物各0.5 μl，tap酶0.2 μl,灭菌注射用水16.3 μl。反应条件：预变性95℃ 3 min,扩增条件95℃ 45 s,52.2℃ 1 min,72℃ 1 min,34个循环，末次延伸72℃ 10 min。取5 μl的pcr产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，eb染色，在紫外灯下观察并照相。

1.6 结果判定 用美国bio-rad凝胶图像分析系统中quantity-one软件测定il-6 mrna与gapdh mrna逆转录扩增产物的吸光度值，将il-6 mrna与gapdh mrna的pcr产物的吸光度比值定义为il-6 mrna的相对强度。根据比值分为：(-)<0.1,(+)0.1-0.8,(++)0.8-2.0,(+++)≥2.0。

1.7 统计学处理 设检验水准α＝0.05,统计软件使用spss11.5。两组数据比较，计数资料用四格表资料的χ2检验及spearman秩相关检验分析, 计量资料用成组设计两样本资料的秩和检验及直线相关分析。等级资料用成组设计两样本资料的秩和检验及spearman秩相关检验分析。p<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组基线数据 年龄、性别、病程、dukes 分期及分化程度的比较见表1，差异无统计学意义(p>0.05)。表1 两组年龄、性别、dukes 分期及组织学类型的比较（略）

2.2 两组肿瘤组织中il-6 mrna表达情况的比较见表2、图2，差异有统计学意义(p＝0.000)。 表2 两组患者肿瘤组织中il-6 mrna表达情况的比较（略）

2.3 两组中年龄、性别（设男＝1，女＝2）、血清alb浓度，肿瘤的分化程度(按癌细胞分化程度的由低到高，设高分化腺癌＝3，中分化腺癌＝2，低分化腺癌＝1)、dukes分期与il-6 mrna在肿瘤组织中表达相对强度的相关性分析：两组患者血清alb浓度、肿瘤的组织学类型与il-6 mrna在肿瘤组织中表达相对强度呈明显负相关，血清alb浓度与il-6 mrna在肿瘤组织中表达的相对强度r=-0.571,p=0.000。 肿瘤的组织学类型与il-6 mrna在肿瘤组织中表达的相对强度r=-0.379,p=0.002。年龄、性别、病程、dukes分期与il-6 mrna在肿瘤组织中表达相对强度无关，p值分别为0.858、0.462、0.893、0.118。

3 讨 论

il-6是体内炎症反应和一系列病理生理过程的重要介质，是具有多项生物学效应的细胞因子［6］。本实验表明，il-6 mrna在结直肠癌肿瘤组织中的阳性表达率较高(59/63),但在相应的正常黏膜组织中不表达。il-6 mrna在低蛋白血症组癌组织中的阳性表达率较非低蛋白血症组高，且il-6 mrna在肿瘤组织中表达相对强度与血清alb浓度呈明显负相关。有研究发现il-6在结直肠癌患者血清的水平中较正常人高［7］，结直肠癌患者血清中il-6水平的增高可能来自肿瘤细胞的分泌［8］，il-6在结直肠癌患者血清及肿瘤组织中的浓度呈正相关［9］，il-6在浓度高时易引起病理损伤，从而在许多疾病的发病机制中起着重要的作用［6］。研究提示，在结直肠癌患者，由结直肠癌细胞所产生、分泌的il-6进入血液循环，使血液中il-6的浓度增高，通过引起一系列病理生理反应，影响机体对alb的代谢从而导致低蛋白血症的发生。

3.1 il-6主要是通过介导急性炎症反应直接引起低蛋白血症。mcmillan等学者［10］在对胃癌及肺癌的研究中发现，患者血白蛋白的浓度的下降继发于以循环中c反应蛋白(c-reactive protein ,crp)浓度升高为特征的全身炎症反应综合症，而crp可以刺激il-6在机体内的水平增加，体内crp与il-6的浓度呈正相关［11］。il-6是参与机体对肿瘤的免疫和炎症反应的重要介导因子。在炎症及肿瘤的刺激下，机体发生应激反应，代谢状态迅速发生变化，出现以高代谢为特征的代谢紊乱。机体通过分解自体组织获取能量，出现“自噬代谢” 。此时患者氮／蛋白的丢失量往往很大，肌肉等分解放出的氨基酸为肝脏合成急性蛋白提供原料，而肝脏合成alb、转铁蛋白、前白蛋白等受抑制，加之异常丢失，蛋白再分布，使低蛋白血症迅速发生。

3.2 il-6通过介导急性炎症反应引起alb的经毛细血管溢出率(transcapillary escape rate, ter)增高而导致低蛋白血症。有研究提示［12］ il-6可活化内皮细胞，显著上调血管内皮细胞(vessel endothelial cells，vecs)的组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tpa)分泌和tpa mrna的转录，诱发纤溶系统活化，诱发血管通透性增高，使血管内物质的ter随之增高。机体在炎症的刺激下alb的ter是正常生理条件的2～3倍，大量的alb穿出血管壁进入血管外间隙，从而引起低蛋白血症［13,14］。

3.3 il-6通过介导炎症反应引起胰岛素抵抗(insulin resistance,ir)造成低蛋白血症。wellen 等［15］认为ir是一种低度的炎症状态，il-6可能是导致ir的重要原因 。ir使机体对胰岛素的利用率下降，降低了胰岛素促进蛋白合成，阻止蛋白分解的能力，使血alb浓度下降，严重者可发生低蛋白血症。

3.4 il-6通过引起瘦素(leptin)分泌增多而造成低蛋白血症。瘦素是由脂肪细胞产生，是肥胖基因编码的蛋白质，作用于下丘脑影响神经肽y等的释放，发出抑制进食的信号，减少能量的摄人，增加能量消耗。zumbacnech 等［16］提出了“细胞因子－瘦素”学说，他们认为多种炎症细胞因子如：tnf-α、il-6等可诱导瘦素生成增加，造成了感染，肿瘤状态下的消瘦，低蛋白血症为主要表现的严重营养不良。

3.5 il-6通过引起尿alb排出率增加而导致低蛋白血症。有资料显示，il-1、il-6、il-8、tnf-α等细胞因子，可导致肾小球系膜细胞生长增殖，细胞外基质增加，使肾小球基底膜增厚和系膜区扩张,造成尿alb排出率增加，逐渐形成持续性的蛋白尿［17］，大量的alb由尿排出可引起低蛋白血症的发生。

低蛋白血症使患者的抵抗力降低，更易于发生各种细菌的感染，从而加重机体的炎症反应。此时不仅肿瘤细胞、血中的单核巨噬细胞产生il-6，而且由于免疫复合物、内毒素或内皮素等刺激因素，损伤系膜细胞，也可诱导分泌il-6。炎症损伤组织又可刺激巨噬细胞、中性粒细胞、t淋巴细胞及各种系膜细胞分泌il-6。il-6在患者血液中的浓度增高又会加重低蛋白血症，由此形成“炎症反应－低蛋白血症”的恶性循环。

从本实验结果可以发现：il-6mrna 在结直肠癌肿瘤组织中表达的相对强度与肿瘤的分化程度成负相关，而与患者的年龄、性别、病程及dukes 分期无关。有学者通过免疫组化实验发现il-6在结肠癌细胞胞浆中表达［18］。这说明结直肠癌组织产生、分泌il-6量的多少与肿瘤细胞本身有关，分化程度越低的肿瘤表达il-6 mrna 的量就越多，分化程度越高的肿瘤表达il-6 mrna的量就越少。这是因为高分化癌与正常组织相似，成熟度高，恶性度低；低分化癌与正常组织相差很大，成熟度差，恶性度高，这也与实验结果il-6 mrna在结直肠癌肿瘤组织中的阳性表达率较高(59/63),但在相应的正常黏膜组织中不表达的结果相吻合。

如何治疗进展期结直肠癌患者并发的低蛋白血症一直是困扰临床工作者的一个难题。由于癌症患者处于自身相食状态，此时患者的消耗经过单纯的营养支持不能得到补充，用单纯输注alb等普通营养支持治疗癌症低蛋白血症效果不佳［19］。从本实验结果可知，il-6与进展期结直肠癌低蛋白血症的发生、发展有关。 il-6要与其受体il-6r相结合才能发挥作用，那么使用 il-6单抗或 il-6受体拮抗剂来降低il-6的浓度或生物活性或许可成为治疗结直肠癌低蛋白血症的有效方法。但也有研究发现il-6有抗肿瘤作用，这与il-6的免疫调节作用有关［20］。因此，如何调整il-6单抗或 il-6受体拮抗剂的量，在抗肿瘤及治疗低蛋白血症之间找到一个平衡点仍需进一步的研究。

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