正交试验法优选五味子种子中木脂素类成分的相

　五味子习称“北五味子”，是一味常用中药，为木兰科植物五味子Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的作用，多用于久咳虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴、心悸失眠等症状。现代研究表明，五味子具有抗肝损伤、抗氧化、抗菌、抗病毒、促进代谢、抗肿瘤等药理作用，五味子中含有的化学成分主要有木脂素类、萜类、多糖类及有机酸类等，其中木脂素类成分与抗肝损伤、抗氧化作用明显相关。20世纪70年代初，我国临床研究中发现五味子能明显降低肝炎患者血清谷丙转氨酶水平，并开发出治疗肝炎药物联苯双酯，由此掀起了对五味子木脂素的研究热潮。五味子中的木脂素主要为联苯环辛烯类木脂素，又称五味子类木脂素，其中五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素等含量较高。本课题组先期研究发现，五味子中的木脂素类成分90%以上存在于种子中，与文献报道一致。对五味子药材中木脂素类成分的提取工艺研究，目前已有多篇文献报道，但未见五味子种子中该类成分提取工艺的相关报道。本研究以五味子种子中总木脂素提取量为指标，采用正交试验法优选了五味子种子中木脂素类成分的提取工艺，为相关制剂生产及本课题下一步制备提取物给予大鼠灌胃采集含药血清，采用血清药理学与血清药化学相结合的方法研究五味子类木脂素保肝活性及构效关系奠定了基础。
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器
　　756MC紫外-可见分光光度计（上海第三分析仪器厂），Sartorius BT 25 S型电子天平（德国赛多利斯公司）。
　1.2 试药
　　五味子乙素（批号1100765-200710，纯度≥98%），购自中国食品药品检定研究院；五味子（批号130623），购自南通三越中药饮片有限公司，经南通市药品检验所龚旭东主任中药师鉴定，为Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实；甲醇为色谱纯，乙醇为工业乙醇。
　　2 方法与结果
　　2.1 药材处理
　　称取五味子药材180 g，加适量水（水刚好将药材淹没即可），浸泡5 h，分离果皮和种子，45℃干燥24 h，干燥后将种子粉碎并过三号筛，存干燥器中备用。
　　2.2 五味子总木脂素含量测定方法的建立
　　2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取五味子乙素对照品0.219 mg置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配制成浓度为0.219 mg/mL的对照品储备液，分别精密吸取对照品储备溶液0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mL，至5 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成五味子乙素含量分别为0.438、1.752、3.504、5.256、7.008、8.760 μg/mL的系列对照品溶液。
　　2.2.2 供试品溶液的制备 各正交试验组提取液以4000 r/min离心10 min，上清液置100 mL容量瓶中，用相同的溶剂定容至刻度，摇匀，精密吸取1～5 mL容量瓶中，用相同的溶剂定容至刻度，摇匀，再从中精密吸取0.08 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
　　2.2.3 线性关系考察 取6个浓度的对照品溶液，置石英皿中，紫外-可见分光光度计在254 nm下以甲醇空白溶液调零，在此波长处测定各溶液的吸收度，每份测3次，吸光度取均值，以质量浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=31.3751C+0.0105（r=0.9928），提示浓度在0.438～8.760 μg/mL范围内，五味子乙素的吸光度与浓度有良好的线性关系。
　　2.2.4 精密度试验 取浓度为5.256 μg/mL的对照品溶液连续测定6次，测得吸光度，计算其RSD为0.92%，表明仪器精密度良好。
　　2.2.5 稳定性试验 同一份供试品溶液分别在0、20、40、60、80、100 min测定吸光度，计算其RSD为2.52%，表明供试液在100 min内稳定性较好。
　　2.2.6 重现性试验 取五味子种子粉末6份，采用95%乙醇浓度5倍量回流3次，每次30 min进行提取，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，测定吸光度，每份测3次取均值，计算每份溶液总木脂素的含量，得RSD为2.02%，表明方法重复性良好。
　　2.2.7 回收率试验 采用95%乙醇浓度5倍量回流3次，每次30 min进行提取，按“2.2.2”项下方法定容至5 mL后，精密吸收0.04 mL 6份，分别置10 mL容量瓶中，分别加入对照品储备液50、60、70 μL，每体积2份，测定吸光度，每份测3次取均值，计算回收率。结果见表1。
　　表1 回收率试验结果
　　2.2.8 样品测定 参照正交试验不同方案，按“2.2.3”项下方法测定，根据五味子乙素回归方程计算总木脂素提取量。
　　2.3 正交试验设计及结果分析
　　以回流次数、回流时间、乙醇浓度和乙醇用量为考察因素，每个因素设3个水平，称取五味子种子粉末约5 g，共9份，选用L9（34）正交表安排试验。按“2.2”项下建立的方法测定各试验组总木脂素提取量，并对结果进行直观和方差分析。因素水平见表2，试验设计结果见表3，方差分析见表 4。
　　从表3中极差可以看出，各因素对五味子种子中木脂素类成分提取率影响的大小顺序为：A（回流次数）>B（回流时间）>D（乙醇用量）>C（乙醇浓度），由表4方差分析结果可知，A因素（回流次数）对提取率有极显著影响（P < 0.01），B因素（回流时间）有显著影响（P < 0.05），C因素（乙醇浓度）、D因素（乙醇用量）对无明显影响（P > 0.05）。从生产实际综合考虑，确定最佳提取工艺为A3B3C3D2，即5倍量95%乙醇，回流提取3次，每次60 min。
　　2.4 工艺验证试验
　　称取五味子种子粉末3份，每份50 g，按优选的工艺条件提取，并测定总木脂素提取量，结果分别为39.317、37.453、43.167 mg/g，表明优选的提取工艺稳定可行。
　　3 讨论
　　五味子中木脂素类成分最常用的方法为溶剂提取法，且常用回流的方法提取。木脂素亲脂性强，用有机溶剂提取较好，王茹等比较了甲醇、氯仿、乙醇、环己烷等对五味子乙素和五味子醇甲的提取效率，发现甲醇和乙醇提取效率较高，考虑到经济、安全、适宜工业化生产等因素，最终选择用乙醇作为提取溶剂进行工艺优选。综合以上分析，本研究选用乙醇采用回流提 取法进行提取工艺研究。
　　对于采用正交试验法优选五味子中木脂素类成分的提取工艺研究，以往的研究多以1个或几个代表性木脂素提取量为考察指标，如蒋益萍等以五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素为考察指标，肖建春等以五味子醇甲和五味子乙素为考察指标，俞金等以五味子乙素为考察指标，分别采用正交试验法考察了五味子药材中木脂素类成分的提取工艺，结果均不一样。迄今为止从五味子中分离得到的五味子类木脂素约50个，单一指标不能全面反映木脂素类成分的提取效率。有鉴于此，本实验采用正交试验法，以总木脂素提取量为考察指标，优选了五味子种子中木脂素的提取工艺。
　　目前采用正交试验法优选的五味子中木脂素类成分提取工艺结果均不一样，如蒋益萍等优选的工艺为8倍量95%乙醇回流提取2次，每次2 h；肖建春等优选的工艺为8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h；俞金等优选的工艺为6倍量85%乙醇回流提取3次，每次2 h。从本研究结果看，回流次数和回流时间的结果的影响有统计学意义，故选择最优的水平，乙醇浓度和用量对结果的影响无统计学意义，最终确定的工艺乙醇浓度选择了最优水平，对于乙醇用量，最优的水平虽为水平1（4倍量），结合以上文献研究结果，为保证提取完全，也考虑了节约成本，最终选择了水平2，即5倍量。
　五味子中总木脂素的含量测定方法主要有变色酸法和紫外分光光度法。变色酸法测定的是五味子类木脂素结构中的亚甲二氧基（-OCH2O-）与Ecgrine试剂（变色酸浓硫酸试剂）反应的甲醛，但五味子中含量较高的五味子醇甲、五味子甲素等不含有亚甲二氧基，并且在强酸作用下，一些含有呋喃环的木脂素成分会释放出一定量的甲醛，对结果均会造成误差。紫外分光光度法易于操作，所以本研究采用该法测定五味子总木脂素的含量。紫外分光光度法根据溶剂的不同测定波长，甲醇作为溶剂时测定波长254 nm，故选用254 nm作为测定波长。
　　
　　 国家药典委员会.中国药典.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：61.
　　 张海，周燕妮，孙森，等.HPLC-TOF/MS分析五味子中3个木脂素类成分在大鼠肝微粒体中的代谢速率及代谢产物.第二军医大学学报，2014，35（4）：426-431.
　　 窦志华，罗琳，陈洁玉，等.五味子含药血清中木脂素类成分的UPLC-MS/MS分析.中国临床药理学杂志，2013， 29（3）：215-218.
　　 牟遇霖.五味子抗肿瘤的研究现状.中国医药导报，2010，7（2）：84-85.
　　 窦志华，罗琳，安莉萍，等.五味子血清药化学初步研究.中药材，2013，36（7）：1146-1148.
　　 窦志华，罗琳，安莉萍，等.五味子乙醇提取物的UPLC-MS/MS分析.医药导报，2013，32（2）：239-241.
　　 王青，王莹，宋小妹，等.UHPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中6种木脂素类成分及其药代动力学研究.中成药，2014，36（2）：266-271.
　　 胡俊扬，陆兔林，毛春芹，等.HPLC法同时测定不同产地五味子中8种木脂素类成分.中成药，2012，34（2）：313-316.
　　 商红军.北五味子乙素提取纯化及生物活性研究.沈阳：沈阳农业大学，2011.
　　 窦志华，安莉萍，陈敏，等.一测多评法同时测定五味子中6种木脂素类成分含量.中国药学杂志，2014，49（2）：147-151.
　　 葛会奇，贾天柱.HPLC测定五味子的最佳采收期及五味子醇甲在果实中的分布.中成药，2007，29（6）：862-864.
　　 蒋益萍，张巧艳，张宏，等.正交试验优选五味子木脂素类成分的提取工艺.中成药，2013，35（11）：2390-2394.
　　 莫永俊，汪春泉，王琦，等.大孔树脂纯化五味子总木脂素、总三萜工艺研究.中国医药导报，2013，10（5）：106-108，111.
　　 肖建春，陈帅，罗森，等.正交实验法优选五味子中木脂素的提取工艺.华西药学杂志，2012，27（6）：692-693.
　　 俞金，崔佰吉，张秀荣，等.正交实验法优化五味子醇溶性有效成分的提取分离工艺.医药导报，2010，29（9）：1192-1194.
　　 胡正芳，柳燕，贾树田，等.大孔树脂与氧化铝联用纯化南五味子总木脂素的工艺优选.中国实验方剂学杂志，2013，19（3）：36-39.
　　 邓翀，颜永刚，梁婷，等.多指标综合评价南五味子木脂素提取工艺.中国实验方剂学杂志，2011，17（9）：4-6.
　　 顾蔚，李宗霖，王喆之.华中五味子中木脂素提取工艺研究.中药材，2010，33（9）：1501-1503.
　　 曹丽萍.五味子木脂素提取方法研究.辽宁中医药大学学报，2011，13（1）：185-187.
　　 王茹，张琰，程建峰，等.五味子活性成分提取工艺的优选.华南国防医学杂志，2005，19（6）：4-6.
　　 安莉萍.五味子质量控制及血清药化学研究.南京：南京中医药大学，2014.
　　 徐佐旗.五味子综合利用的初步研究.镇江：江苏大学，2006.