流感病毒的反向遗传学研究进展

　　反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。在病毒学研究中，反向遗传学常利用经修饰的克隆化cDNA用来获得有感染性的病毒，从而可研究这些修饰对表型产生哪些影响。最早报道的是正链RNA病毒的反向遗传学系统。将来自正链RNA的病毒全基因组RNA转染真核细胞，可使RNA充任mRNA(s)从而可翻译出病毒蛋白；反过来，这些蛋白又有助于完整病毒的包装。

　　与正链RNA病毒不同，负链RNA病毒的基因组无信使功能并且无感染性。从病毒RNA开始转录需要病毒的核糖核蛋白复合体（RNP)的存在。RNP对病毒RNA转录为mRNA和病毒基因组的复制是必须的。利用反向遗传学，从cDNA获得的第一个完整负链RNA病毒是狂犬病毒。另有一些研究者对Semia、Ebola病毒进行了反向遗传学研究，但拯救效率较之正链RNA病毒低得很多。

　　分节段的负链RNA病毒的反向遗传学操作尤显困难。通过努力，分节段的负链RNA病毒的反向遗传学最终在布尼亚病毒上获得突破，并随后在流感病毒等取得了一系列进展。此文就流感病毒的反向遗传学的发展历史及其应用作一综述。

　　1.流感病毒的反向遗传学发展概述

　　流感病毒属正粘病毒科成员。同多数负链RNA病毒不同，流感病毒在感染细胞的核内完成复制。在受体介导的吞饮和膜融合之后，病毒的核糖核蛋白复合体（vRNP)释放入细胞浆。vRNP包括病毒RNA、核蛋白（NP)和3个多聚酶蛋白（PB1、PB2和PA)被运送至细胞核，在此完成转录和复制。负链的病毒RNA不能作为蛋白质合成的直接模板。相反，NP包裹的vRNA必须经病毒多聚酶转录为mRNA在复制中，病毒RNA作为全长互补RNA(cRNA)的合成模板；合成的cRNA又可作为子代病毒RNA的合成模板。所以流感病毒复制的最小功能单位是vRNP复合物。故A型流感病毒的产生需要8个功能性的RNP复合物，并且这8个复合物必须进入细胞核。

　　在实验室水平体外产生病毒始于20世纪80年代。其时已从感染的细胞和变性剂处理的病毒中获得具有复制功能的vRNP，其后有学者又证实了vRNP的体外活性。1989年，Parvin等和其同事获得了从克隆化cDNA获得的vRNA的病毒，从而首次建立了对负链RNA病毒进行体外修饰的系统，揭开了重配病毒研究的新篇章。Enami等14将体外转录后的vRNA、纯化的NP和多聚酶蛋白装配成RNP复合物。但是这个系统所产生的子代病毒多是辅助病毒，所以需要从抗体介导的生长限制作用、温度敏感性、宿主限制型和抗性等方面进行严格的筛选。1994年，Hobom等利用RNA多聚酶I来合成病毒RNA，从而把流感病毒的反向遗传学研究推向一个新的高度。RNA多聚酶I是细胞核内含量丰富的酶，它能转录没有5,帽子和^尾巴的rRNA(类似于流感病毒的vRNA)此外，该酶还能在特定的启动子和终止子序列处启动或终止转录。因此RNA多聚酶I的转录产物在<端和^端没有冗余的核酸。RNA多聚酶I系统比RNP直接转染系统更为有效，因为它能进行体外转录、蛋白质纯化和体外RNP装配。但是该系统和上述系统一样，存在病毒产毒量特别低的缺点。

　　随着狂犬病毒的感染性cDNA克隆的诞生和一个分节段的负链RNA病毒一布尼亚病毒的反向遗传学的成功，从克隆的cDNA产生流感病毒的技术难关终于在1999年得到突破。Neumann研究小组161构建了含A/WSN/33CH1N1)全部8个基因片段的克隆，所有基因片段均置于人RNA多聚酶I启动子和鼠RNA多聚酶终止子序列之间，另外9个真核表达质粒负责病毒蛋白的合成，此即17质粒系统，在转染细胞上清中，产毒量达1X107/mU随后，该小组对17质粒系统进行了改进，将负责蛋白合成的真核表达质粒改为4个，分别负责PA、PB1、PB2和NP的合成，以供病毒RNA的转录和复制之用。该系统称为12质粒系统，转染上清中能产生高达1X108/mL的病毒粒子。其转染效率很高的原因。

　　Hoffmann等17|对RNA聚合酶I系统进行了改进。编码病毒基因片段的cDNA以负链方向克隆于RNA聚合酶I启动子和终止子序列之间；构建好的表达盒又正向插于RNA聚合酶II启动子和牛生长激素poty(A)信号之间。这样，RNA聚合酶I负责转录产生负链病毒RNA，而RNA聚合酶II负责正链mRNA的合成，从同一模板便可同时产生vRNA和mRNA，无需另外的质粒来负责蛋白质合成。这个系统称为8质粒系统，有助于不能高效转染的细胞系产生重配病毒。另外，这个系统避免了在一个或多个基因片段产生致死性突变的病毒样颗粒的产生。8质粒拯救系统相对于17/12质粒系统，减少了表达各病毒蛋白的质粒，使拯救时需要转染细胞的质粒数大大减少，因此提高了病毒拯救效率。相当于RNA聚合酶1+辅助病毒系统，但由于没有辅助病毒的使用，从而免去了复杂的病毒筛选工作。没有外源(辅助）基因的干扰，可以按预期计划获得目的重配病毒。

　　随后，Neumann等探索了减少转染所需质粒数量，以期提高转染效率。他们将负责病毒RNA合成的元件克隆到1个质粒上，而把负责蛋白质合成的基因分别克隆到另外的载体上，再进行不同的组合，使转染所需质粒的数量减少为1~6个。例如，和以前由每个质粒提供RNA多聚酶I和II转录盒不同，他们把负责合成病毒RNA的8个RNA多聚酶I转录盒组合到1个质粒上；同样地，把负责病毒多聚酶单位合成的PB2、PB1、PA和NP分别克隆到pCAW,S载体上，5个质粒共转染后，病毒能在Vero细胞上大量增殖，TCID5Q/mL能达到6.3X105。这种改进，克服了传统的鸡胚源疫苗的局限性，也改变了既往的17或12质粒系统、8质粒系统在疫苗允许细胞(例如Vero细胞）上转染效率低的缺点，有利于高效快速地制备流感疫苗。

　　2.流感病毒反向遗传学的应用进展

    2.1流感病毒跨种属传播机制研究高致病性禽流感病毒为何能从飞禽传播给哺乳动物？又能否在人之间互相传播？探讨这一可能性对有效防制流感至关重要。目前，有关流感病毒跨种属传播机制的研究不多。反向遗传学可以用于从分子水平探讨流感病毒跨种属传播的可能性及其机制。例如，目前一个最突出的问题是:哪些基因的变化，导致H5N1流感病毒获得在人类高效传播的能力？解决这一问题，可能就需要利用反向遗传学技术产生候选病毒，结合一个合适的动物模型，来模拟流感病毒在人之间相互传播，以探讨其机制。

　　流感病毒的各个基因片段在流感病毒跨种属传播中扮演了什么角色，又是哪些因素限制了其传播？Hatto等在12质粒系统中1101,将人流感病毒A/Memphis8/88(H3N2)的HA、NA、NP、M、NS、PB2分别更换禽流感病毒A/Mallard/NewYork/6750/78(H2N2)基因组中相应片段，而保持禽流感病毒基因组中的其他基因片段不变。当仅替换A/Mem¬phis/8/88的HA或NA片段时不能产生禽的病毒；当同时替换人流感病毒的HA和NA片段时，才得以成功拯救出活病毒颗粒。因此，HA和NA之间的平衡对病毒复制是重要的，毒株本身固有的温度敏感性可能也是一个重要的限制因素。与之相似，包含人流感病毒PB1或PA基因的重配禽流感重配病毒得到拯救。但此病毒却不能在鸭的肠道中复制，可能是因为它和禽流感病毒的宿主细胞因子不兼容。

　　已知猪的呼吸道上皮细胞存在禽流感和人流感病毒的受体，所以存在禽流感通过猪感染人的危险。Gabriele等1111保持人流感病毒（Sw/ONT)其他6个片段不变，采用8质粒系统，将猪H3N2毒株(Sw/MN)的HA/NA取代人H3N2病毒的HA/NA得到的重配病毒(Sw/ONT+MNHA/NA)在病毒出芽率和致病性方面较供体株有所增强；反之，将人流感病毒的HA/NA片段置换猪流感病毒相应片段，则重配病毒(Sw/MN+ONTHA/NA)出芽率和致病性下降。由此说明HA/NA对人的流感病毒感染株起着重要作用，从而推测在猪的细胞中存在种属屏障，限制了人流感病毒和禽流感病毒在猪体重配而产生流感大流行的可能性。

　　Taubenberger等112则利用12质粒系统成功地拯救了1918年的流感病毒。其研究结果揭示，现在流行的H5N1病毒基因必须发生一定的变化，才有可能通过低滴度的气溶胶传播给人，并由此造成流感大流行。其中，PB1基因扮演着关键的角色，因为在1957年和1968年流感病毒重配过程中，多聚酶基因随血凝素基因一起发生转移。比较三株禽流感病毒和人西班牙流感病毒的PA、PB1和PB2中保守序列，发现PA中的4个氨基酸（5N、100A、382D、552S)、PB1中的1个氨基酸（375S)和PB2中的5个氨基酸（199S、475M、567N、627K、702R)仅存在于人流感病毒（包括1918年病毒)，在禽流感病毒中未发现。进一步研究表明，这些氨基酸只见于人流感病毒的核定位信号区。这些氨基酸的部分或全部差异对禽流感病毒传播到人至关重要。Taubenberger等还比较了1997年香港人禽流感病毒和2004年越南人禽流感病毒的序列，发现其含有对1918年流感病毒感染人有关键作用的PB2的5个氨基酸中的一个。这个结果暗示，这些禽流感病毒必须发生这样和其它一些基因变化，才会在人群传播。因此，及时监测人禽流感病毒的关键区域的序列变异，并在宿主机体高效复制以前，及时追踪病毒演化，从而制定相应的全球性防制策略。

　　2.2疫苗研发目前使用的流感疫苗是通过鸡胚生产并用物理方法纯化和灭活的灭活疫苗。每年，WHO都会筛选出在人群中流行的代表株，推荐用于生产疫苗。疫苗的效果取决于疫苗株必须和流行株有很大的相似性，以保证产生有效的中和抗体。但是并非所有的这些候选毒株都适合于疫苗生产，有些候选毒株在鸡胚上生长欠佳。因此，现有的做法就是把高产的实验室毒株A/PR/8/34(H1N1)和当前流行毒株加以重配，用以生产疫苗。但是通过这种方法得到高产毒株有很大的不确定性，而且这种方法只能适合于直接从鸡胚分离的毒株；而从某些细胞系中分离得到的毒株就不能通过这个途径成为疫苗株。

　　反向遗传学的问世和发展为生产合适的疫苗株提供了可能性。其一，与以前那祌‘命中或错过”的疫苗株筛选方法相比，这种方法直接而合理;其二，反向遗传学可以消除那些非允许细胞系分离毒株可能带来的污染或者其他病原体；其三，通过对质粒进行操作，可以改造HA和其他影响病毒毒力的基因，以去除那些致病因素。

　　株，比减温培养条件下含单个碱基变化的ts和ca突变株更为稳定。已知流感病毒的NS1蛋白可以抑制干扰素引起的抗病毒效应。将NS1蛋白截短后，例如只保留N端的99或126个氨基酸对小鼠只产生短暂的抗干扰素效应，由此得到的重配病毒可作为疫苗的供体株。另一个有前途的策略是产生M2基因的敲除突变株。敲除了M2基因，就会得到一个在细胞培养物上生长良好，在小鼠体内生长能力差的复制缺陷株。

　　Brownlee研究小组1141所采取的策略是在保守的病毒RNA启动子区进行碱基替代。利用12质粒系统改变保守碱基，就会得到致弱毒株。这种方法的可行性已在PA、NA和NS基因上得到证明。如果在病毒基因组的8个片段中任意片段都能引入突变，就会产生弱毒株。这种突变对研制活疫苗的供体株很有用处。

　　反向遗传学还可使灭活疫苗的研制周期缩短，工艺简化。传统的方法耗时繁琐，并且要求足够的鸡胚供应，这对应对流感大流行是不现实的。如前所述，Schickli和Hoff¬mann等分别使用不同的质粒系统得到重配病毒。这些病毒在鸡胚上或哺乳动物细胞上有很高的血凝滴度，并有亲代流行株的表面抗原。当新的毒株流行之际，只需将流行毒株和高产供体株加以重配，就可以得到新的疫苗株。利用反向遗传学进行疫苗研制的不利之处在于使用了293T和MDCK细胞。前者是转化细胞系，后者适宜性也一直得到质疑，故不适于生产人用疫苗。另一局限处在于，人RNA聚合酶I启动子只适合于人传代细胞或其原代细胞。Ozaki等在8质粒系统探讨了利用Vero细胞进行转染的可能性。Vero细胞是允许用于疫苗生产的细胞。在胰蛋白酶存在下，病毒可以在Vero细胞进行复制。较之鸡胚源疫苗，在Vero细胞上得到的流感疫苗可以产生相对强的体液免疫效应和更高的细胞毒性T淋巴细胞反应.

　　基于此，反向遗传学是应对流感大流行的一个重要手段。人感染禽流感已见于1997(H5N1)、1999(H9N2)、2003(H5N1和H7N7)、2004(H5N1和H7N3)、2005(H5N1)在这些A型流感病毒中，H5和H7亚型和高致病性感染密切相关。其致病性与糖蛋白HA的裂解位点处多个氨基酸基序相关。这些基序的存在，累及多个存在外源性蛋白酶的组织器官。从这个角度说来，虽然目前所用的疫苗多源自鸡胚，但安全性还尚待考察，因其可能会引起潜在的公共卫生问题。为研制高致病性流感病毒的疫苗候选株，Subbarao等116和Wkbby等117分别采用12质粒系统和8质粒系统，各自敲除了1997年和2003年的H5N1毒株的碱性氨基酸基序。这些疫苗株含H5N1的修改的HA和NA，以及A/PR/8/34的内部基因，在鸡胚上生长良好，得到高滴度的子代病毒。含修饰的HA的病毒与野毒株相比，其对鸡和小鼠的致病力都降低了。Subbarao等报道，甲醛灭活1997突变重配株激发的免疫效应与同样灭活的H5N1野毒株相当。Stech等则另辟蹊径，将血凝素蛋白上的胰蛋白酶裂解位点突变为弹性蛋白酶裂解位点，从而获得一个致弱突变株。与致死的野毒株相比，其在小鼠上完全致弱。以105PFU的重配病毒免疫小鼠，其能保护小鼠抵抗致死剂量的野生病毒攻。

　　2.3病毒毒力及其致病性研究已知从人分离到的禽流感病毒包括高致病性和低致病性两类。不同的病毒在鼠中引起的疾病与在人群中引起的疾病相关。为了弄清不同致病性的分子基础，利用12质粒系统产生了高致病性的禽流感H5N1亚型的HK483株和无致病性的HK486株1191.然后将HK483株的每个基因片段引入HK486株，检测重配后的病毒对小鼠的致病性。当将HK483株的PB2基因引入到HK486株后，HK486株致病性增加；反之，HK483株得到减毒。由此看来HK483株的PB2基因决定了病毒的潜在致病性。为寻找PB2中决定致病性的关键位点，将编码的单个氨基酸替换，得到重配病毒，从而发现两个毒株的PB2蛋白有8个氨基酸的差异。进一步发现627位的谷氨酸是决定高致病性的关键位点。另外，研究发现，HK486株的HA的227位由丝氨酸变化为异亮氨酸时，其毒力降低。

　　Salomon等1201在8质粒系统中研究了一个对人类致死的毒株A/Vietnam/1203/04(VN1203)和一个非致病毒株A/chicken/Vietnam/C58/04(CH58)在雪貂和小鼠上的致病性。发现两者的血凝素分子上有6个氨基酸的差异、相同的剪切位点和禽样的alpha：(2，3)连接受体特异性。奇怪的是，交换他们的血凝素和神经氨酸酶基因并没有改变他们各自的致病性，但是以CH58置换VN1203的多聚酶基因后，使后者完全致弱并降低了多聚酶活性。以CH58置换VN1203的N基因后，对雪貂的致病性得以降低，而对小鼠的致病性未变。这揭示了，具有可剪切的血凝素的禽H5N1病毒，其多聚酶基因（PB2、PB1等）必须进行适应性的变化，才能突破种属屏障，从而在哺乳动物产生高毒力。

　　2.4病毒基因组结构与功能的研究利用反向遗传学，可以对病毒的编码基因进行定向突变,从而可以知道该基因的编码产物在病毒的生命周期中的作用，从而为药物和疫苗设计奠定结构生物学和细胞生物学的基础。

　　有学者根据A/HK/213/03(H5N1)和A/Vietnam/1203/04(H5N1)两株病毒的血凝素蛋白抗原性不同筛选出两个候选疫苗121]。这两者的HA1亚单位有10个氨基酸不同，其中A/Vietnam/1203/04毒株的154位有潜在的糖基化位点。为了评价主要的5个抗原位点对免疫原性和免疫保护的影响,他们包装产生了一系列有1个或2个氨基酸不同的全病毒。将这些病毒灭活后免疫雪貂，能产生很高的中和抗体，但是血凝抑制效价很低。而HA的223位S变换为N(A/HK/213/03)后，血凝效价就提高了。这个结果暗示，HA上的特定残基例如N223可以增加血凝滴度的敏感性。这是由于受体特异性和抗原抗体结合特异性改变了。随后通过突变得到的疫苗，能使雪貂抵抗A/Vietnam/1203/04的攻击。

　　又如，流感病毒的M1蛋白和HA、NA蛋白协同作用，促进了病毒粒子的装配。而含97个氨基酸的M2蛋白是否在病毒装配中发挥了作用??Horimoto等[22]利用12质粒系统产生了一系列的M2胞质尾区敲除突变体。研究发现，敲除M2的C末端22个氨基酸的重配病毒在电镜下可见但是生长状况较野生病毒欠佳。分析该重配病毒，发现其RNP较野生病毒明显减少。在形态学上，野生病毒是球形击？-2016ChhaAcad^dcJournalElectronicPublish的而重配;病呈丝状。丙氨酸分区诱变法进步揭示，M胞质尾区的74~79位氨基酸在病毒粒子的形态学和感染力中有重要作用。由此说明，A型流感病毒的M2胞质尾区在病毒的装配和形态发生上扮演了重要角色。

　　3.结语

　　反向遗传学使得人们可以对负链RNA病毒的基因组直接进行修饰，为研究病毒的复制和装配提供了有力的手段。未来，反向遗传学的应用领域会进一步扩大，人们对单个基因在病毒毒力和致病性方面作用的认识进一步清晰，从而为筛选活疫苗的候选株提供更合理的基础。对于灭活疫苗，反向遗传学可以更加准确地弄清增强疫苗重配株在鸡胚或者细胞培养上增殖的特定序列，这对降低疫苗成本和评价应对流感大流行疫苗的效能有显著贡献。但是，利用反向遗传学生产的疫苗在许多国家被界定为基因修饰有机体，因此在准许作为临床使用品之前，广泛的安全性实验和争论将会持续。

　　如上所述，反向遗传学对阐明病毒的基因组结构与功能，从而对药物设计、理解流感病毒变异和跨种属传播的分子机制等方面仍将会继续发挥其重要作用。例如，阐明流感病毒的宿主特异性和致病性是流感病毒研究的未来方向之一，其中一个注目的问题是：为何禽H5N1病毒没有和人流感病毒发生重配??弄清这一问题的唯一方法就是利用反向遗传学在实验室条件下模拟这个重配过程，将重配的病毒和野毒株加以比较，从而探讨其分子机制。另外，反向遗传学可能对研究病毒基因如何发生变异、病毒是如何通过编码产物逃避宿主的免疫反应等机理的研究都会发挥重要的作用。因此，反向遗传学同RNAi、SELEX等定向进化技术一样，仍将是流感病毒研究中一个重要的研究工具。