反向遗传学策略及其在寄生虫研究中的应用

　　反向遗传学（eversegenetics)是从基因的结构出发，认识基因的功能的学科。在遗传学的杂交分析时代，人们从生物体的性状改变来认识基因，称为正向遗传学（orwa_dgenetics)随着人们对基因的研究和认识的深入，如今更多情况下是运用物理和化学的原理以及计算机技术和实验技术直接剖析基因的物质结构，在分子水平上揭示基因的结构和功能。当人类基因组计划（humangenomeprojectHGP)完成，并进入后基因组时代之后，大量已测序基因的功能有待进一步阐明。因此，运用与发展分析基因功能的反向遗传学的方法和技术已日渐成为生物研究领域的热点。

　　1反向遗传学策略

　　正向遗传学的思路是从表型开始，确定相关的基因;而反向遗传学正好相反，是从一个新基因开始，希望确定相关的表型。

　　一旦基因序列得到确定，接下来就是阐明其功能。判定未知基因的功能可以通过计算机分析和实验研究。计算机分析基因功能最有力的工具之一是同源性检索(homologysearch),同源性检索可提供整个基因或基因片段的功能信息。但同源性检索并不能确定所有新基因功能，需要用实验方法来补充和扩展同源性检索的结果，这才是基因功能研究中最大的问题。

　　传统研究的基本原则是通过确定突变体中的失活基因来确定对应于表型的基因。如果从基因而不是表型出发，那么相应的策略就是进行基因突变，确定该基因所导致的表型改变，这就是用于确定未知基因功能的实验技术基础。下面是实验室中常用的几种反向遗传学方法。

　　1.1通过灭活基因确定未知基因功能

　　采用实验技术在分子水平上灭活特定基因，然后从整体上观察表型改变，可以推测相应基因的功能。灭活特定基因的方法有以下几种。

　　1.1.1基因敲除(geneknockout)

　　早期，人们用基因敲除将一个结构已知但功能未知的基因剔除，或用其他顺序相近基因取代，然后从表型改变推测相应基因的功能。比如Mota等通过基因敲除技术研究TRAP基因在伯氏与约氏疟原虫中的功能及其差异。传统的基因敲除方法虽然可以确定一些基因的功能，但存在技术要求高、操作过程烦琐、花费大等方面的弱点，在一定程度上限制了它的广泛应用。

　　1.1.2反义RNA(antisenseRNA)

　　反义RNA作为反向遗传学的另一种方法，曾广泛应用于研究基因功能，至今在基因功能鉴定上仍发挥着作用。Yao等利用反义RNA下调基因表达，分析了利什曼原虫表面蛋白水解酶的重要作用。但是用反义RNA关闭基因表达具有作用较弱等缺点。

　　1.1.3RNA干扰（RNAinterferenceRNAi)

　　外源和内源性双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)在细胞内诱导同源序列的基因表达受到抑制的现象称为RNA干扰，是1998年由Fire首次发现并命名的转录后水平的基因沉默，是《Sci-ence?和《Nature)〉评出的2002年度最重要的科技成果之一，以其简单有效的特点正成为替代其他基因灭活方法的重要的反向遗传学研究工具。

　　1.2基因过表达（geneoverexpression)

　　Simonet等利用此技术研究小鼠，用含有仅在肝细胞中表达的高活性启动子使小鼠过表达OPG(osteoprotegeiin)基因，得到的转基因小鼠的骨密度明显高于正常小鼠，说明该基因参与骨质合成。1.3其他研究基因功能的方法

　　定点诱变（site-directedmutagenesis)或体外诱变(invitromutagenesis)可以用来探索基因的具体功能。使用各种定点诱变或体外诱变可以缺失或改可合成蛋白质，并保留主要活性。通过这种方法可以研究基因中某些序列编码的氨基酸在整个蛋白质中所起的作用，如可能是控制蛋白质在细胞中的定位或者负责蛋白质对化学信号的反应等；利用定点诱变还可以产生基因的突变体比较突变体与原基因的功能差异，可进一步认识基因的功能。如黄长晖等通过体外定点诱变生成抑癌基因P16的P48L和D74N突变体来研究该基因的功能5

　　此外，基因功能的线索可以通过研究基因表达的时间和空间来获得。如果基因的表达限制在多细胞生物的特定器官或组织，或者器官或组织中的某类细胞，那么这种定位信息就可以用来推测基因产物的一般功能。

　　2以RNAi为基础的反向遗传学在寄生虫研究中的应用

　　2.1概述

　　RNAi作为反向遗传学的一种方法，为后基因组时代的基因功能分析提供了一个可靠而又快速的应用平台。RNAi克服了传统的基因剔除、转基因等方法的弱点，以其快速、可靠、经济的特点受到越来越多生物学家的重视。RNAi正广泛应用于基因功能研究。

　　Kiehl等将在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditisele-gans)肌肉和神经组织中高度表达的未知功能的atx-2基因和fox-1基因的双链RNA分别导入L4期幼虫体内触发产生RNAi,发现atx-1基因表达被干扰后，幼虫的下一代胚胎发育受到抑制；当fox-基因表达受到干扰时，成虫的产卵率明显下降。从而得知atx-1基因和fox-1基因的表达分别与胚胎发育和成虫生殖有关61。Fraser和Conczy等合成了大量与开放读框相对应的特异性的dsRNA以及表达这些dsRNA的细菌克隆，结合子代分析和时间推移差异干扰比较显微分析（time-lapsedifferentialinterferencecontrastmicroscopyassay)的方法，成功地在基因组水平上大规模地筛选了功能基因，证明了秀丽隐杆线虫一号、三号染色体上与早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等相关基因的功能。Vayssie等在溶组织内阿米巴中通过RNAi证明了7-微管蛋白对于微管成核作用（microtubulenucleation)的重要性。Levashina等用dsRNA敲除蚊虫的一种补体样蛋白基因，证明了它在昆虫与脊椎动物免疫吞噬作用中的功能具有保守性。Blandin等用除蚊虫的防御素基因（祝細gene)证明了它的功能。Bettencourt等通过注射dsRNA到cecropiapupae来沉默其Hemolin基因揭示了它对下一代的胚胎正常生长具重要作用。

　　2.2分子机制

　　Fiie等将dsRNA导入线虫体内观察到RNA干扰现象。然而将dsRNA(长^30bp)导入到较高级的哺乳动物培养细胞，出现的不是特异的RNA干扰，而是细胞的基因表达全面受抑制和细胞凋亡等现象;Zamoie等发现诱导产生干扰时dsRNA被切成21~25个碱基的RNA片段^15],这种小片段的RNA也存在其他生物的RNA干扰模型中，被称为小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),RNA干扰可能正是由siRNA诱导。研究表明，RNA干扰可能的机制和过程是:外源dsRNA进入细胞后，与一些蛋白质RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)等结合，在螺旋酶等的协同下，dsRNA被大量复制；然后在一种类似核酸酶II的RNA内切酶Dicer作用下，dsRNA被降解成21~25nt大小的小片段dsRNA,即siRNA;siRNA和某些尚不确定的蛋白质结合形成复合物--RNA诱导沉默复合物（RNA-inducingsilencecomplex,RISC)在RISC形成过程中，已知起作用的酶蛋白有Dicer酶和AGO(argonaute)蛋白家族中的AGO2Dicer与AGO2通过二者都具有的PAZ结构域（Piwi，Argonaute,Zwille/pineheadPAZ)相互作用，从而促进了RISC形成。RISC特异性地识别、结合mRNA,并且RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA,切割位点就是与siRNA中反义链互补的mRNA序列;被切割后的断裂mRNA随即降解，从而使蛋白质合成失去了所依赖的mRNA模板，产生了转录后的基因沉默(post?transcriptiongenesilencingPTGS)。研究显示，RNAi具有放大效应，被降解的mRNA片段及未被降解的完整mRNA均可作为引物，在RdRP作用下，合成更多的dsRNA,新合成的dsRNA再进入新一轮的RNAi循环;在这种类似正反馈的作用方式下，靶mRNA逐渐减少，呈现基因沉默现象。

　　2.3特点与意义

　　RNA干涉对基因功能的研究具有许多传统方法无法比拟的特点与优势，因此越来越受到研究者的关注。首先，特异性地只抑制目的基因是RNAi最显著的特征;其次，抑制基因表达的高效性与抑制效应在细胞之间的可传播性也是RNAi的重要特点。当进入后基因组时代，人们需要大规模高通量地研究基因功能。传统的方法可能需要花费6个月的时间关闭某个基因，RNAi技术却可以在一周中关闭10个基因的表达。正是因为RNAi能高效特异地抑制基因表达，RNAi已逐渐成为替代其他基因功能研究方法不可缺少的工具。美国麻省理工大学医学中心的PhillipZamore预言：“RNAi将在哺乳动物细胞遗传学上引起革命性的变化。”

　　3可遗传的反向遗传学在寄生虫研究中的进展

　　最初的RNAi技术是通过注射或浸泡等方法直接将dsRNA导入到线虫的性腺或早期胚胎中，虽然观察到RNA干扰现象，产生表型变化，但这种变化却不能遗传或遗传效应不强。在蠕虫的小肠内注入dsRNA,能引起蠕虫各部位的RNAi效应，也能下传一代至数代，但只在第一代中比较稳定。

　　为解决RNAi效应不可遗传的问题，Tav-ema'akis等对RNAi技术进行了改进，将目的基因靶序列以反向重复方式插入热激蛋白启动子Hsp16-2的下游，然后将其转入宿主菌中，热激处理后，反向重复序列（IR)在细胞内开始转录并产生具有发夹环结构的RNA(hairpin-loopRNA),这种发夹样的dsRNA进行RNA干扰，则能获得稳定的遗传，即建立了可遗传的RNAi技术f2021。改进后的RNAi技术运用了转基因技术，与传统的RNAi相比具有明显的优点，除了可以遗传外，dsRNA可以被诱导产生，使得RNAi能够在发育特定阶段出现，从而可以研究发育早期必需基因在发育晚期的功能;此外，如果用细胞特异性启动子控制dsRNA的表达，就可以研究特定基因在不同器官中的功能。这种可遗传和可诱导的基于转基因的RNAi技术将进一步推动反向遗传学向前发展。

　　建立dsRNA可遗传和可诱导的表达需要选择合适的可诱导启动子。常用的启动子如热激蛋白启动子(heatshockprotein,Hsp)直接作用较弱且短暂，并且在生物体生长过程可能产生不必要的作用。为避免此类问题发生，Kennerdell和Ca'thew用GAL4/UAS二分系统控制dsRNA在果蝇中的表达，实现了稳定的诱导性或细胞特异性控制RNAi的发生。他们的做法是将目的基因与UAS相连转入一果蝇体内，热激启动子或其他组织和阶段特异性启动子与GAL4连接转入另外一只果蝇，当二者作为亲本杂交后，产生的后代体内可以通过GAL4/UAS系统激活目的基因，出现相应的表型。在构建dsRNA的反向重复序列中插入短的内含子序列就可以进一步提高RNA干扰作用的效率。同样，在GAL4/UAS系统的基础上建立的可诱导可遗传的dsRNA表达策略也可运用于蚊虫及其他寄生虫基因功能的研宄。

　　在蚊虫的可遗传RNAi可选用Vg(vitel-logenin)启动子。Vg基因可以启动蚊防御素（dfi-frnsins)的表达。Vg基因的上游包含3个调节区域:近侧区（121/-619)负责低水平的组织和阶段特异性的表达，中间区（619/-1071)负责Vg表达的阶段特异性激素的增强，远侧区（-1071/-2015)对Vg高水平表达是不可缺少的。

　　布氏锥虫的RNAi效应持续时间较短，不能传递到子代细胞。研究发现主要因为dsRNA在布氏锥虫易被降解所致，降解dsRNA的酶对转基因寄生虫保持稳定的RNAi效应至关重要。对于布氏锥虫的可遗传的反向遗传学研究已经构建了两种RNAi载体:一种是采用四环素诱导的启动子载体将反向重复的基因序列插入到启动子的下游，生成发夹环结构的dsRNA,需要三步克隆构建载体;另一种是利用四环素诱导的一对反向的T7RNA聚合酶启动子载体在两启动子中间插入目的基因序列，然后在体内产生dsRNA,仅需一步克隆。因此，双T7启动子系统适用于大规模基因功能分析。

　　4常用于反向遗传学的模式生物

　　通过了解较为简单的模式生物（modelorgan-ism)的基因组，可为哺乳动物和人类的基因功能鉴定提供线索；并且可以通过从简单的基因组分析入手建立技术、积累经验。

　　4.1秀丽隐杆线虫

　　1998年由Fire命名的RNAi正是在秀丽隐杆线虫中发现的。这种线虫已成为生物学中一个非常重要的模式生物。此线虫所有的基因序列已知，适合于反向遗传学研究，许多实验室选择它作为研究和发展反向遗传学技术的材料。目前，用RNAi技术分析这种线虫全部19000个基因的研究正在进行中。此外，秀丽隐杆线虫基因组功能分析也弄清了许多保守的生物过程和分子途径。而且，从秀丽隐杆线虫到人类的进化保守性十分明显，其许多已知基因都与人类基因有明显的配对，其中包括与人类疾病有关的基因。

　　4.2布氏锥虫

　　学实验的寄生虫。Ngo等用a-微管蛋白dsRNA使布氏锥虫的细胞微管蛋白mRNA表达下调，从而使表型发生改变。Bastin等构建了一种可诱导反向表达副鞭毛杆蛋白（paraflagellarrodproteinPFRA)的锥虫细胞系snl-2。通过诱导，PFRA基因的dsRNA表达，PFRA蛋白迅速消失，使副鞭毛的构造也受到影响，导致细胞不能运动。Wang等用RNAi研究布氏锥虫的拓扑异构酶II的功能，发现它在线粒体DNA的网络式调节中起重要作用[31]。在锥虫中已用RNAi抑制了许多mRNA的表达，然而大约一半的实验研究中，虽然下调了表达，表型并没有发生改变，可能因为有一些具有抵抗性的细胞通过重组取消了插入的反向重复序列的作用，使细胞中总有剩余的mRNA,基因合成的产物并未完全消失。尽管如此，RNAi已为布氏锥虫的反向遗传学研究提供了一个新颖有力的工具，并将继续进行下去。

　　4.3弓形虫

　　弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫。与其他多数寄生虫相比，弓形虫是一种在实验室中易于操作加工的生物，它具有高效转化性，易繁殖，易观察和可利用的细胞标记物多等特点;更重要的是，对弓形虫的基因组研究显示，它的部分基因与RNAi相关的重要酶蛋白基因具有同源性，如AGO,Dicer和RdRp。弓形虫的速殖子可表达大量的AGO样蛋白质，这些AGO样蛋白中也包含AGO具有的PAZ和Piwi两个结构域。因此，弓形虫可能是特别适用于RNAi的生物之一。通过与其他原虫生物比较发现，弓形虫所具有的许多特点决定了它是顶端复合物中一个非常好的进行反向遗传学研究的模式生物。到目前为止，关于弓形虫的反向遗传学的报道并不多，仅有Nakaar等用反义核酸下调相应基因;Malhotra等使用dsRNA使半胱氨酸蛋白水解酶（cysteineproteases)沉默;Al-Anouti等利用RNAi抑制了尿嘧啶磷酸核糖转移酶（uracilphos-phoribosyltransferaseUPRT)的表达。有的实验室使用RNAi下调弓形虫某些基因未能出现相应的表型变化，其原因是多方面的，如使用的dsRNA量不够大，选用的启动子作用不够强，等等，还有待进一步的研究。

　　4.4蚊虫

　　蚊虫是疟原虫最主要的媒介，是媒介与寄生虫相互作用研究的重要模式生物。近几年来，对蚊虫转化的发展，可诱导的组织特异性启动子的鉴定和蚊基因组序列的获得等。许多实验室通过转基因作用制备各种转基因蚊用于疟原虫及其他方面的研究。将蚊虫转基因技术和传统的RNAi结合起来已建立稳定的可遗传的反向遗传学技术。此外，用dsRNA沉默基因的方法已查明蚊虫的抗微生物多肽基因一防御素DefA的功能，并且通过沉默后表型的分析揭示了这种多肽对于蚊虫抵抗革兰氏阳性菌作用是必需的[11。常用于实验室研究的蚊虫有中华按蚊（Asinensis)、白纹伊蚊（ctus)和埃及伊蚊(O等几种。其中埃及伊蚊的卵能保存长达6个月以上，可以有大的基因储备；并且，埃及伊蚊基因组和表达序列标签（EST)工程将很快会带来大量基因分子的信息;这种蚊也非常适合进行转基因操作，可以利用可遗传的反向遗传学获得稳定转化的转基因蚊，用于科学研究。

　　5应用与展望

　　可以预测，在转基因与RNA干扰技术基础上建立的可遗传和可诱导的反向遗传学技术将是今后反向遗传学研究的重要平台，具有广阔的研究与应用空间。作为未来反向遗传学重点运用和发展的RNAi虽然人们对它的认识已有长足的进步，但仍有许多问题尚待进一步阐述。如:外源基因是如何产生dsRNA的？设想中的RISC组成成分如何？选用怎样的启动子和载体系统可以使RNAi效应达到理想效果？

　　目前反向遗传学研究比较深入的几种寄生虫，如布氏锥虫和蚊虫均可以作为模式生物。虽然已有的有关弓形虫的反向遗传学研究十分有限，但研究表明弓形虫具有许多非常适合反向遗传学研究的特点，因此，它必将成为一种重要的模式生物。通过对具有独特研究优势和(或)基因组与人类有较大同源性的模式生物的研究，不仅可以积累经验，探索与发展技术还可以为人类基因的功能鉴定提供线索。可以预期，随着反向遗传学研究技术的日益成熟，其在寄生虫基因功能研究中的应用也将越来越广泛和深入。