农杆菌介导棉花遗传转化的影响因素
摘要分析了农杆菌介导的棉花遗传转化的影响因素：棉花基因型是影响体细胞胚胎发生的关键因素；培养1周且分化不成熟的棉花下胚轴是诱导胚胎发生的首选外植体；高比值的KT/2，4-D可有效诱导胚性愈伤组织的产生，低比值则可以促进体细胞胚胎发生；葡萄糖比麦芽糖更适合诱导产生愈伤组织。在转化过程中，胚性愈伤是农杆菌侵染较合适的原始转化材料；菌液的培养温度、浓度、侵染时间及乙酰丁香酮（AS）浓度都会影响组织的转化效率；合适的抗生素浓度也是抗性愈伤筛选的必要保证。
关键词棉花；农杆菌介导法；遗传转化；诱导培养；影响因素
中图分类号：S562文献标志码：CDOI：.1673-890x.2020.22.002
棉花（Gossypiumspp）是世界上最重要的经济作物之一，在全球经济中扮演重要角色，棉花纤维是纺织业的重要原料，棉秆和棉籽等都可以用作生物质能源原料。棉花属于锦葵科（Malvaceae）棉花属（Gossypium），该属有超过50个种，广泛栽培的有4个种，其中陆地棉（GossypiumhirsutumL.）的种植面积超过全球棉花种植面积的90%。虽然传统育种技术在提高棉花产量、纤维品质、棉籽油品质和高温耐受能力等方面取得了较大的成功，但常规育种方法得到的棉花品种不同程度地存在种子活力低、易受虫害草害影响、生长发育偏慢、易发生茎枯病等问题。转基因方法可以通过直接或间接转化手段，有目的地向棉花体内引入控制性状遗传的优良基因，实现生物性状的定向改变，从而提高棉花产量，改良纤维品质，增强植株抗虫、抗除草剂、抗病能力和抗逆性。
1987年，Umbeck、Firoozabady等先后报道了通过农杆菌介导法将新霉素磷酸转移酶（NPTII）作为选择标记基因转入珂字棉312和珂字棉210[1-2]。随后农杆菌介导的体细胞胚发生转化法成为国际上普遍使用的棉花转化手段。传统的农杆菌介导法常用下胚轴或子叶作为受体，从共培养开始，在选择培养基上产生数百个独立转化事件的愈伤组织，愈伤组织经过胚胎诱导及体细胞胚向正常植株发育和萌发，最终长成再生植株，这种多步骤的转化周期较长（一般为10～12个月），转化效率较低。
近年来，不少研究发现胚性愈伤组织作为受体感染农杆菌时，恢复自身正常生长和存活需要更少的时间，缩短了整体培育周期，转化效率更高[3-4]。与下胚轴和子叶相比，胚性愈伤组织可能是更好的原始转化材料。这种方法与其他棉花转化方法相比，更加简单、可靠和高效，省时省力。
本文主要从以下两方面分析通过农杆菌介导法侵染获得再生植株的影响因素：愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生的影响因素；农杆菌介导愈伤组织遗传转化的主要因素。
1愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生的影响因素
体细胞胚胎发生是体细胞被重新编程发育成类似受精卵形成的胚胎的过程。体细胞胚胎发生有直接发生、间接发生两种形式。在直接发生方式中，外植体的单个细胞直接发育成胚的类似物；间接发生方式中，体细胞胚的形成要经过一个脱分化过程形成愈伤组织。1979年，Price和Smith[5]首次报道了从克劳茨基棉花的细胞悬浮培养中获得了体细胞胚。1983年，Davidonis、Hamilton[6]首次从陆地棉中获得完整的再生植株。棉花体细胞胚胎是获得完整转基因植株的关键，这个过程较为复杂，受细胞内、外多种因素影响，主要包括内在因素（植物基因型、外植体类型等）和外在因素（培养基成分、外源生长调节因子等）。
1.1内在因素
1.1.1基因型
基因型是影响体细胞胚胎发生的主要因素[7]，影响体细胞胚胎发生的其他因素都取决于棉花基因型。众多研究表明，不同棉种、同一棉种不同品种的胚胎发生和植株再生能力差异很大，在诱导体细胞胚时所需用的生长调节剂浓度和培养条件等差别也很大[8]。为了研究基因型对体细胞胚胎发生的影响，Trolinder将38个栽培种分别用4种生长调节剂组合方式处理，在所有生长调节剂处理中珂字312的胚胎发生率最高，随后是珂字304、珂字315和珂字310，其余基因型在所有生长条件下的胚胎发生能力较差[9-10]。目前国内外许多实验室均从珂字棉得到了较多的再生植株，珂字棉已成为棉花组织培养的模式品种，广泛应用于棉花组织培养及其遗传转化等研究中。也有一些研究发现非珂字棉品系如岱字棉[11]、中国培育品种YZ-1[12]的胚胎发生率也很高。
在四大栽培种中，陆地棉体细胞胚胎发生较易，亚洲棉次之，海岛棉和非洲棉较差[13]。棉花体细胞胚胎发生和植株再生是一种受多基因控制的遗传特性，选育新品种时可以珂字棉为亲本进行系统或杂交选育，将这些基因传递给育出的新品种，这样就会保留住亲本中的体细胞胚胎发生能力和植株再生能力[14]。
1.1.2外植体
成熟组织（茎、叶、根、叶柄）和非成熟组织（子叶、下胚轴、地上分生组织）都可作为外植体诱导体细胞胚胎生成[15]。一般而言，内源生长素含量较多的外植体更易生成胚胎[16]，不成熟的外植体可能由于含有较高水平的内源生长素而比成熟组织拥有更强的胚胎发生能力。Trolinder和Goodin以生长3d的珂字棉312为材料，比较了多种外植体胚胎发生能力，结果表明下胚轴最易诱导体细胞胚胎发生，中胚軸和上胚轴次之，种子和子叶较差，叶片和茎段最差。Sakhanokho等研究也发现下胚轴比子叶更易诱导胚胎发生，并首次用下胚轴和子叶培养出海岛棉（enseL.）的再生植株[17]。子叶下胚轴作为外植体要比子叶所需的培养时间短，并且可阻止无性系变异的发生[18]。另外，下胚轴最易诱导出优良的愈伤组织[19]。很多研究者都是利用3日龄或6日龄的棉花无菌苗的下胚轴，切成3～5mm的小块进行愈伤组织的诱导。建议在棉花组培过程中最好选用无菌苗的下胚轴作为外植体。
1.2外在因素
1.2.1培养基组成和植物生长调节剂
高质量愈伤组织的形成是再生出完整棉花植株的关键因素，其中生长调节剂是最重要的影响因子。高比值的细胞分裂素/生长素可有效诱导胚性愈伤组织的产生。在几个棉花品种中，2，4-D和NAA是更加有效的生长素类似物，虽然二者在诱导胚胎发生过程当中并无本质区别，但2，4-D可以更快速地诱导胚胎发生。2，4-D抑制胚性愈伤组织分化为胚状体，因此在胚状体生长的培养基中一般要去除2，4-D。所有细胞分裂素中，2iP和KT在诱导胚胎发生中效果尤为显著，2iP、KT分别与2，4-D共同使用时胚胎发生率可达到41.9%、23.5%。2，4-D+KT组合是棉花组织培养中的常用植物生长调节剂组合，广泛用于棉花愈伤组织的诱导和体细胞胚胎发生中[20]。还有其他植物生长調节剂组合也被成功应用于不同棉花品种的体细胞胚胎发生，其中IBA+KT组合通常用来继代培养胚性愈伤组织和促进体细胞胚胎发生，近年来也被成功应用于愈伤组织的诱导和分化调控[21]。
此外，还有一些其他生长调节剂，如IBA和IAA也是愈伤组织诱导时常用的生长素类似物，但之后需用NAA替换才能形成胚胎[22-23]。用子叶下胚轴作外植体可在以毒莠定为生长素源的培养基上获得胚性愈伤组织。Benzylaminopurine（BAP）和2，4-D共同作用也可有效诱导胚性愈伤组织的形成[24]。也有报道称只有两种细胞分裂素而无生长素或只有两种生长素类似物而无细胞分裂素的组合也可以诱导胚胎发生[25]。在所有方法中，Trolinder等、Firoozabady等采用的生长调节剂组合（0.1mg·L-12，4-D+0.1mg·L-1KT，5.0mg·L-12iP+0.1mg·L-1NAA）对于多种栽培种均可以获得疏松的愈伤组织。大多数研究者在这两种方法的基础上依据培养条件和基因型，调整生长调节剂浓度来获得胚性愈伤组织[26]。
1.2.2碳源
碳源也是影响棉花愈伤组织诱导和体细胞胚形成的一个重要因素，难再生的棉花品种只能在某一特定的培养基里再生。在愈伤组织的诱导和增殖中最常用的是MSB培养基，即MS培养基的无机盐与B5培养基的有机成分相配合的培养基。在培养基的碳源选择上，棉花愈伤组织诱导宜用葡萄糖作为碳源，而胚性愈伤组织增殖、保存和胚状体的萌发过程宜使用麦芽糖作碳源[27]，也有试验表明4%的葡萄糖是诱导愈伤组织的最佳选择。
2农杆菌侵染胚性愈伤组织的影响因素
传统的农杆菌介导法常用下胚轴或子叶作为受体，通过体细胞胚胎发生技术获得再生植株。Wu等在培育抗虫转基因棉时发现转化愈伤组织比转化其他外植体（下胚轴、子叶）可减少6个月的时间。另外，胚性愈伤组织作为外植体时，Southern杂交分析表明大约有15%的转化效率，平均每个培养皿能鉴定出8～12个阳性苗。Wu等采用该方法在短时间内每个愈伤组织获得30～100个植株，GUS染色阳性率为72.60%[28]。因此，与子叶下胚轴或子叶相比，胚性愈伤组织可能是最好的原始转化材料。农杆菌介导法成功运用主要依赖以下几个因素：农杆菌将基因转入特定基因组的转化能力；转化细胞的再生能力。这两个因素又依赖于其他几个影响因子，如基因型、外植体、农杆菌种类、乙酰丁香酮浓度等。
2.1农杆菌菌株
农杆菌菌株对转化效率影响很大。Sunilkumar和Rathore等用农杆菌侵染陆地棉子叶圆盘发现LBA4404的转化效率明显高于EHA105[29]。Tohidfar等用LBA4404、EHA101和C58侵染子叶和下胚轴时，LBA4404的转化效率最高[30]。Leelavathi等、Wu等都利用农杆菌LBA4404侵染陆地棉胚性愈伤组织获得转基因棉。Jin等在转化陆地棉胚性愈伤组织过程中也发现LBA4404的转化效率远高于C58C3。杆菌菌株如AGL1、GV3111、GV3101也被用于转基因棉的培养[31]。转化陆地棉时推荐使用LBA4404菌株，转化效率较高。
2.2乙酰丁香酮（AS）
AS是受伤的植物组织分泌的酚类化合物，它能够诱导Ti质粒中一系列Vir基因的表达[32]，这对于T-DNA的转移是必须的。Sunilkumar等首次在棉花转化时的农杆菌生长阶段和共培养阶段添加100μM的AS，发现可以显著提高珂字棉312和其他3个栽培种（TAM-94L25、TAM-89E51、TAM-94WE37S）的转化效率[33]。Jin等在转化胚性愈伤组织时设置了不同的AS浓度梯度，结果发现在50mg·L-1（250μM）时可显著提高转化效率；当AS浓度达到100mg·L-1（500μM）时，转化效率降低[34]。Wu等在转化时添加0、25、50、75mg·L-1的AS，发现AS浓度为50mg·L-1的转化效率最高[35]。合适的AS浓度可以提高棉花转化效率，但AS浓度高于500μM时会降低转化效率。综上所述，共培养期间添加50mg·L-1的AS时，转化效率较高。
2.3农杆菌感染浓度、感染时间
农杆菌感染浓度对转化效率有很大的影响。Jin等报道侵染棉花愈伤组织时，菌液感染浓度OD600为0.5时的转化效率比OD600为1.0或1.5时的转化效率更高。大多数研究者在侵染愈伤组织时采用的农杆菌感染浓度OD600值为0.3～0.5，Wu采用OD600为0.2～0.3的菌液进行侵染。刘传亮等构建棉花规模化转基因技术体系时，发现在原有转化体系中，选择的侵染浓度OD600值为0.3～0.7时，许多切段容易死亡，而适当降低菌液感染浓度OD600值至0.1～0.3可提高愈伤组织发生率，侵染15～20min为宜。刘卫民等试验表明侵染棉花下胚轴所用的农杆菌浓度OD600为0.4～05，侵染时间在10～15min时，转化效率最高，返菌率也很低；而侵染时间为20～30min时，转化率急剧下降，返菌率也显著升高。综上所述，农杆菌感染浓度OD600值为0.3左右时，转化效率较高。另外，在压力为186.158kPa时，用农杆菌菌液真空渗入10min可以显著提高转化效率，比常规转化效率高出一倍多[36]。
2.4共培养温度和时间
Sunilkumar、Rathore和Jin等用可视化蛋白GFP作为标记，随着时间观察转基因的定位，该技术可以帮助优化影响转化效率的各种因素，尤其是共培养时间和温度。此外，采用可视的筛选标记可以在早期轻易找到转基因表达细胞系。试验发现农杆菌侵染42～45h后可观察到GFP的表达，共培养3d后GFP稳定且大量表达，4d时所有细胞内均可检测到GFP表达。但外源基因在转基因材料中的瞬时表达和稳定表达是相关联但又不同的，因为高水平的瞬时表达并不一定会导致高水平的稳定转化。多数棉花转化体系会采用48h的共培养时间。Wu等通过GUS染色发现共培养48h、72h时，转化效率并无差异。培养时间过长，愈伤组织会出现褐化和坏死现象，出愈率较低[37-38]。
共培养温度也是影响转化的重要因素。研究者对共培养温度为21℃、25℃时，农杆菌LBA4404的转化效率进行了研究，发现共培养温度为21℃时，转化效率更高。Wu等在研究农杆菌侵染陆地棉愈伤组织时，设置了19℃、23℃、26℃等3个共培养温度梯度，结果发现共培养温度在19℃时，转化效率达到最高[32]。
2.5抗生素
在农杆菌介导转化法中，有两类常用的抗生素，一类具有筛选作用，如卡那霉素和潮霉素；另外一类用来杀死农杆菌，如氨苄青霉素和头孢霉素（500mg·L-1）。在遗传转化中，很多基因以NPTII（抗卡那霉素）作为选择标记基因，卡那霉素的使用浓度是影响转化效率的一个重要因素。有研究表明，将卡那霉素浓度设为25mg·L-1，愈伤组织呈淡黄色，生长迅速，成活率为98%～100%；浓度上升为50mg·L-1时，愈伤局部生长速度变缓，成活率在80%以上；而当浓度提升至100～150mg·L-1时，愈伤生长缓慢甚至停滞，成活率也下降至14%～40%。很明显，高浓度抗生素对植物产生毒害作用，低浓度抗生素会导致非转化细胞生长旺盛，再生受到抑制，无法对抗性愈伤起到筛选作用。棉花子叶和下胚轴作为外植体诱导胚性愈伤组织发生时，10mg·L-1或更高浓度的卡那霉素使愈伤组织形成数量减少；浓度达到60mg·L-1时，愈伤组织的生长、增殖和体细胞胚胎发生的诱导过程完全受到抑制。成熟的体细胞胚对卡那霉素不敏感，此阶段很难筛选到转化子[39]。
在转基因的愈伤组织诱导和增殖阶段，卡那霉素的最佳使用浓度为40～60mg·L-1；而在筛选转基因的胚性愈伤组织和体细胞胚时，卡那霉素的浓度应增加至200mg·L-1。100mg·L-1的卡那霉素筛选3次，7～8周，也能获得很好的筛选效果。
另外，在培养基中原始愈伤组织的大小也会影响愈伤组织的出愈率，规格较大的愈伤组织更易存活下来。及时传代培养及培养皿中愈伤组织的数量也会影响体细胞胚胎的发芽率，这是棉花组培中的一个重要步骤。因此，研究人员必须注意这些方面以提高整体转化效率。
3結语
近些年来，随着转化技术体系的不断创新和完善，农杆菌介导的棉花遗传转化得以在全国范围内推广开来，呈规模化生产。例如，中国农业科学院棉花研究所李付广研究员主持的“棉花规模化转基因技术体系平台的建设及其应用”有效组装多种转基因技术，实现了规模化、高效率的棉花转基因技术操作，年均获得转基因棉花植株6000株以上，不仅降低了转基因成本，还拓宽了受体的基因型范围和外植体范围。现阶段除了棉花下胚轴之外，叶柄、真叶和根等都可以通过农杆菌转化获得完整的转基因植株，但有待进一步探究农杆菌介导的棉花遗传转化过程受众多内在和外在因素的综合影响的分子机制，以便将遗传转化应用于更多的商用棉花品种，减免杂交回交，缩短育种年限。