高效液相色谱法测定甘草中甘草查尔酮A的含量

作者：崔永明，石月，陈悟，曾庆福，余龙江

【摘要】 　　目的建立甘草中甘草查尔酮a的含量测定方法。方法采用高效液相色谱（hplc）法，使用hypersil ods2色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm），以甲醇-水-冰醋酸（60∶40∶1）为流动相，流速1.0 ml·min-1, 检测波长为372 nm，柱温 25℃。结果甘草查尔酮a线性范围0.2～1.0 μg, r=0.999 2；精密度实验rsd为1.51 %；重复性实验rsd为2.54 %；稳定性实验rsd为1.72 %；平均加样回收率98.76 %，rsd=1.94 %。结论该方法灵敏、准确，重复性好，可作为甘草中甘草查尔酮a的含量测定方法。

【关键词】 甘草 甘草查尔酮a 高效液相色谱法

　　abstract：objectiveto establish a determination method of licochalcone a in licorice. methodsusing hplc method, the system consisted of hypersil ods2 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm),mobile phase of methanol-water- glacial acetic acid (60∶40∶1) mixture, with a flow rate of 1.0 ml·min-1; detection wavelength was at 372 nm column temperature of 25 ℃. resultslinear range was 0.1～1.0 μg with the r of 0.999 2,precision test ,repeation test ,and stability test were 1.51%,2.54% and 1.72%,respectively .the mean recovery was 98.76 %, with respectively rsd of 1.94 %. conclusionthe methoed is sensitive, accurate and with good reproducibility and can be used as the determination method of licochalcone a.

　　key words：licorice; licochalcone a; hplc

药用甘草为豆科植物乌拉尔甘草glycyrrhiza uralensis fisch.，胀果甘草glycyrrhiza inflata bat.或光果甘草glycyrrhiza glabra l.的干燥根及根茎，是多年生药用草本植物。植化研究表明甘草中存在大量的酚类成分，这些具有生物活性的成分有望成为开发新药的来源［1］。甘草查尔酮a(licochalcone a)是存在于甘草中的一种酚类查尔酮化合物［2］，临床及药理研究表明，甘草查尔酮a具有抗氧化［3］、抗炎［4］、抗菌［5］、抗肿瘤［6］、抗利什曼原虫病［7］、免疫促进和雌激素样［8］等活性，在临床上具有广泛的应用前景，但有关其含量测定的方法还未见报道。本文建立了甘草查尔酮a的hplc含量测定方法，为进一步开发甘草中这一重要活性成分提供简便可行的检测方法。

　　 1 仪器与试剂

美国agilent 1100液相色谱仪系统；kq-100db型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

甘草由新疆昆仑神农有限公司赠送，经新疆甘草种植中心鉴定分别为乌拉尔甘草glycyrrhiza uralensis fisch.，胀果甘草glycyrrhiza inflata bat.和光果甘草glycyrrhiza glabra l.。甘草查尔酮a对照品，本实验室自制，经质谱、碳谱和氢谱鉴定为甘草查尔酮a(licochalcone a), 归一化测定含量为98.81%。乙腈、甲醇为色谱纯；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

　 　2 方法与结果

　　2.1 溶液制备

　　2.1.1 对照品溶液的制备准确称取在60℃干燥至恒重的甘草查尔酮a对照品适量，用流动相配成浓度为0.1 mg·ml-1的对照品储备液，待用。

　　2.1.2 供试品溶液的制备准确称取干燥恒重甘草粉末（过60目筛）0.5 g，置100 ml具筛锥形瓶中，加入甲醇25 ml，超声处理（功率200 w，频率40 khz）30 min，过滤，再加入甲醇20 ml，超声处理30 min，合并滤液，减压浓缩至干，加流动相溶解并定容至50 ml，微孔滤膜(0.45 μm)过滤，即得供试品溶液。

　　2.2 色谱条件

　　色谱柱为大连依利特 hypersil ods2 c18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱温25℃；流动相为甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)；检测波长372 nm；流速1.0 ml·min-1。

　　2.3 方法学考察

　　2.3.1 线性关系考察

　　准确吸取甘草查尔酮a对照品储备液2，4，6，8，10 ml分别置于5个10 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。分别吸取上述对照品溶液各10 μl，依次注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以浓度c(μg/ml)为横坐标，色谱峰面积a为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：a=41 308 c-142 057，r=0.999 2， 线性范围为：0.2～1.0 μg。

　　2.3.2 精密度实验

　　准确吸取浓度为100 μg·ml-1的甘草查尔酮a标准品溶液10 μl，重复进样5次，测得峰面积值， 计算 相对标准偏差rsd为1.51%，说明仪器良好。

　　2.3.3 重复性实验

　　准确称取同一批次的胀果甘草5份，按“2.1.2”项下制备样品溶液，依次测定，根据标准曲线换算甘草查尔酮a的含量，计算甘草查尔酮a含量的rsd为2.54%，表明实验方法重复性较好。

　　2.3.4 稳定性实验

　　取同一份待测供试品溶液，在0, 2, 4, 8, 12 h进样测定，测得甘草查尔酮a峰面积值并计算样品峰面积的rsd为1.72%，表明供试品溶液于12 h内稳定。

　　2.3.5 加样回收率实验

　　准确称取已知含量的样品约0.1 g(共5份)，精密加入0.10 mg/ml的甘草查尔酮a标准品1 ml，按“2.1.2”项下方法制备所需溶液，测定并 计算 含量。表1结果表明甘草查尔酮a平均回收率为98.76 %，rsd为1.94 %。表1 样品加样回收率实验结果（略）
　
　　2.4 样品测定

　　按照本方法的测定条件，分别测定《 中国 药典》收录的3种甘草样品，计算甘草查尔酮a的含量，结果见表2。甘草查尔酮a标准品及样品hplc图谱见图1～2。表2 甘草查尔酮a含量测定结果（略）
　
　 　3 讨论

　　3.1 色谱条件选择

　　比较了乙腈-水(60∶40)、甲醇-水(70∶30)、甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)、乙腈-甲醇-水(40∶30∶30)等流动相体系，结果第3种流动相分离效果最好，所以，本文选用甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)为流动相。

　　3.2 溶液制备方法

　　比较了不同提取溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）和提取方法（回流提取，索氏提取，超声提取）的提取效果，结果表明甲醇对甘草查尔酮a的提取效果优于其他两种溶剂，索氏提取和超声提取的效果相当，均优于回流提取，但索氏提取耗时较长，故本文以甲醇为提取剂采用超声提取制备样品供试溶液。

　　3.3 检测波长的选择在200～700 nm之间对甘草查尔酮a对照品溶液进行光谱扫描，结果表明在372 nm处有极大吸收，故选择372 nm为检测波长。

结果表明该方法简单，快捷，专属性强，准确度高，具有良好的重复性，可用于甘草中甘草查尔酮a的含量测定。

【 参考 文献 】
　　［1］shibata s. a drug over the millennia: pharmacognosy, chemistry, and pharmacology of licorice［j］. yakugaku zasshi， 2000, 120(10): 849.

　　［2］wang qe, lee sc, wang xr. isolation and purification of inflacoumarin a and licochalcone a from licorice by high-speed counter-current chromatography［j］. j chromatogr a. 2004, 1048(1): 51.

　　［3］haraguchi h, ishikawa h, mizutani k, et al. antioxidative and superoxide scavenging activities of retrochalcones in glycyrrhiza inflata［j］. bioorg med chem， 1998, 6(3): 339.

　　［4］cui ym, ao mz, li w, et al. anti-inflammatory activity of licochalcone a isolated from glycyrrhiza inflata ［j］. z naturforsch， 2008, 63c: 361.

　　［5］haraguchi h, tanimoto k, tamura y, et al. mode of antibacterial action of retrochalcones from glycyrrhiza inflata ［j］. phytochemistry， 1998, 48(1): 125.

　　［6］iwata s, nishino t, inoue h, et al. antitumorigenic activities of chalcones (ii). photo-isomerization of chalcones and the correlation with their biological activities［j］. biol pharm bull， 1997, 20(12): 1266.

　　［7］chen m, zhai l, christensen sb, et al. inhibition of fumarate reductase in leishmania major and l. donovani by chalcones ［j］. antimicrob agents chemother， 2001, 45(7): 2023.

　　［8］rafi mm, rosen rt, vassil a, et al. modulation of bcl-2 and cytotoxicity by licochalcone-a, a novel estrogenic flavonoid［j］. anticancer res， 2000, 20(4): 2653.