五味子水溶性多糖提取及纯化工艺的优化

作者：姜波，孙静，刘春，范圣第

【摘要】 　　目的研究五味子多糖提取工艺参数及参数的评价方法。方法用水提取醇沉法提取五味子多糖，通过单因素及正交实验，研究固液比、提取温度、提取时间及提取次数对五味子多糖得率的影响，并对多糖得率的质量评价和含量评价方法进行探讨，同时进行了多糖的纯化研究。结果提取温度对五味子多糖得率的影响最大，固液比、提取时间对五味子多糖得率影响较小。通过测定提取的多糖含量计算五味子多糖得率与单纯用多糖质量（所得沉淀）计算的五味子多糖得率的比较存在一定的差异，表明采用含量测定的方法比单纯的质量比所确立的条件更准确。结论五味子多糖提取的最佳工艺条件为：固液比1∶30，提取温度90℃，提取时间4 h，提取3次。用活性炭与sevage法联合使用纯化多糖，使提取的多糖纯度由43.48%提高到66.43%。

【关键词】 五味子 多糖 提取 纯化

　　五味子为木兰科植物五味子的果实，因其甘、酸、辛、苦、咸五味俱全，故得名五味子。五味子是名贵中药材，《本草纲目》中记载，五味子益气主治，咳逆上气，劳伤羸瘦，补不足，强阴，养五脏，除热，止呕逆，补虚劳，明目，壮筋骨，除烦热，解酒毒，生津止渴，补元气不足等［1］。临床多用于久咳虚喘、津亏口渴、遗精、自汗、久泻、神经衰弱、肝炎等症［2］。近年来通过大量动物和临床实验发现，五味子还具有保肝、抗衰老、耐缺氧、增强机体免疫力等活性［2，3］。

　　近年来研究发现活性多糖具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、延缓衰老、降血脂、降血糖、解毒、抗辐射等功效［4～8］，其作用日益受到人们的重视。本文利用对环境无污染的水提取的方法，研究了五味子多糖的提取工艺条件，并进行了粗多糖的纯化及多糖含量的测定。在人们常采用的通过依据提取多糖质量的多少（所得的多糖沉淀的质量除以样品的质量）来判断提取工艺条件［9～11］的同时，本文又通过测定提取的多糖中的多糖含量（测得的多糖含量乘以提取多糖质量除以五味子的质量）来选择多糖的提取条件，并将两种方法进行了比较。实验结果表明，采用含量测定的方法比单纯的质量比所确立的最佳条件更可靠。

　　1 仪器与材料

　　1.1 仪器与试剂
　
　　wfj2100型分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司），uv-9200紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司），微型植物试样粉碎机（天津市泰新特仪器有限公司），电子分析天平（上海奥豪斯公司），恒温水浴锅（金北得工贸有限公司），tdl80-28台式离心机（上海安亭精密仪器厂），电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

　　试剂均为国产分析纯。

　　1.2 材料五味子：市购。

　　2 方法

　　2.1 材料的预处理

　　将五味子在65℃烘箱中烘干后用粉碎机粉碎，过80目筛，于棕色磨口瓶中存放备用。

　　2.2 五味子粗多糖提取方法

　　称取一定量的五味子粉于具塞三角瓶中，按实验的设计加入一定量的蒸馏水，放入水浴中按一定的温度浸提。冷却后，以4 000 r/min离心20 min，所得提取液浓缩至原体积的约1/5，然后加入5倍体积的乙醇，摇匀后，在4℃冰箱中放置24 h，以4 200 r/min离心18 min。所得沉淀蒸干乙醇后，在70℃烘箱中烘至干燥，所得固体即为五味子多糖。

　　2.3 粗多糖的纯化方法

　　五味子预处理→蒸馏水浸提→离心→浓缩→sevage法脱蛋白→活性炭脱色→醇沉→离心→干燥→研磨干燥→检测。

　　质量比多糖得率（%）=提取的多糖质量五味子试样质量×100%

　　为了便于区分这个得率以下称为质量比多糖得率。

　　2.4 多糖的含量测定方法采用硫酸-苯酚法，用葡萄糖作为标准测定多糖含量。

　　标准溶液的配制及测定：准确称取0.10 000 g已干燥的标准葡萄糖，溶解后至100 ml容量瓶，用蒸馏水稀释到刻度。用移液管分别取上述配制的葡萄糖标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，转移至100 ml容量瓶，并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。得浓度分别为10，20，30，40，50μg/ml的葡萄糖标准溶液。

　　从上述已配制的葡萄糖标准溶液中分别取出0.6 ml于10 ml具塞试管中，再分别加入5％苯酚（w/v）溶液1.2 ml，迅速加入浓硫酸4.0 ml，摇匀，室温静置15 min,30℃水浴中放置15 min，在486 nm下测其吸光度。

　　样品溶液的配制及测定：准确称取0.01g粗多糖，用蒸馏水溶解后，分别转移至50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用与标样测定相同的方法测定样品中多糖含量。

　　通过标准曲线测得样品浓度后带入以下公式可得到0.01 g粗多糖中多糖含量，再乘以粗多糖干燥后产量可得到2 g五味子中粗多糖量，最终可算出五味子多糖得率。

　　多糖含量（%）=样品浓度×稀释倍数×样品体积多糖试样质量×100%

　　五味子多糖得率（%）=粗多糖多糖含量×粗多糖质量五味子试样质量（2 g）×100%

　　2.5 单因素实验固液比(m/v)选用1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50五个条件，提取温度采用75，80，85，90，95℃ 5个条件，提取时间为1，2，3，4，5 h 5个条件，提取次数为5次。

　　2.6 正交实验选l9（33）正交实验，以确定五味子中水溶性多糖提取的最佳工艺参数。水平因素见表1。表1 水平因素（略）

　　3 结果与讨论

　　3.1 多糖含量的测定

　　经紫外光谱扫描确立多糖测定的最大吸收为486 nm，测得的葡萄糖标准曲线的相关系数为0.999 6，线性方程为y=0.006 9x。

　　3.2 五味子多糖提取的单因素实验研究

　　为了更准确地反映出提取多糖的量，本文除了采用人们普遍使用的直接利用提取的多糖质量与试样质量之比的多糖得率计算方法来考察因素外，还利用定量分析提取的多糖中的多糖含量，继而换算出五味子试样中多糖得率的方法来指示各因素提取多糖的多寡，进而指示各因素的优劣。这样可以避免提取的多糖质量高，即提取的多糖质量与样品质量之比的多糖得率高但多糖含量不一定高的问题。同时也可以说明有的文献中出现的异常数据，使各因素考查的结果更具可信性。

　　3.2.1 固液比对多糖得率的影响

　　在提取温度为80℃，提取时间为3h条件下，进行固液比实验。结果见图1。

　　实验结果表明，随着固液比的增加，多糖得率逐渐增加，但当固液比达到1∶40后，质量比多糖得率却有所下降，但经过多糖含量测定计算的五味子多糖得率逐渐上升，由此可以看出单凭由质量比多糖得率来确立提取条件的不准确。这同时也说明了一些研究中随着固液比的增大，多糖得率反而减小的现象。由图1可以看出，当固液比达到30％以后，五味子多糖得率增加缓慢。

　　3.2.2 提取温度对多糖得率的影响

　　在固液比为1∶30，提取时间为3 h条件下，进行提取温度实验。结果见图2。

　　由图2可以看出，在所选的5个提取温度下，随着温度的升高，多糖的提取率随之升高，到达90℃时最大，而当温度95℃时提取率下降，这可能是由于在较高温度下提取使大分子多糖的糖苷键断裂造成了多糖的部分损失。提取温度考虑为90℃。质量比多糖得率与五味子多糖得率随温度变化趋势基本一致。

　　3.2.3 提取时间对多糖得率的影响

　　在固液比为1∶30，提取温度为90℃条件下，进行提取时间实验。结果见图3。

　　由图3可看出随提取时间的增加多糖得率增加，到3 h后增加幅度缓慢。五味子多糖得率随时间增加缓慢增加，而质量比多糖得率当提取时间为5 h略有降低。

　　3.2.4 提取次数对多糖得率的影响

　　在固液比为1∶30，提取温度为90℃条件下，提取时间为3h条件下，进行5次提取次数实验。结果见图4。

　　由图4可见，第1次提取多糖的得率最高，第2次次之，第3次以后多糖得率较小，实验提取次数3次为宜。质量比多糖得率与五味子多糖得率随温度变化趋势基本一致。

　　3.3 五味子多糖提取的正交实验在单因素实验的基础上，选定3因素3水平正交实验。结果见表2～3。表2 正交实验l9 （33）结果，表3 正交实验方差分析（略）。

　　比较3个因素的极差r值，rb＞ra＞rc，可看出温度对提取多糖得率影响最大，其次为固液比，最后为浸提时间。最佳工艺组合为a2b2c3，即固液比为1∶30，温度为90℃，提取时间为4 h。在此最佳提取条件下提取，得每2 g五味子多糖高达到69.39 mg，五味子多糖得率为3.470％。

　　3.4 多糖的纯化采用活性炭与sevage法联合纯化多糖。首先用活性炭处理。将提取液在水浴中加热至90℃，活性炭与提取液按1∶5（w/v）量加入，搅拌30 min，过滤，用蒸馏水洗涤活性炭层4次，合并滤液后，浓缩。然后用sevage法脱蛋白，氯仿∶正丁醇比例为4∶1（v/v），与提取液的比例为1∶5（v/v），用力振摇30min，4 200 r/min离心15 min。醇沉后，得到精制多糖。

　　3.4.1 活性炭处理实验结果

　　用紫外光谱在280 nm下测定多糖提取液的紫外吸收，活性炭处理前后的吸光度见图5。

　　由图5可见，活性炭处理除掉了大部分的杂质。

　　3.4.2 sevage法脱蛋白用sevage法除蛋白，共做了5次，每次去除蛋白情况见图6。

　　由图6中可看出蛋白质含量在经过1次sevage处理后的吸光度有所减少，但随着处理次数的增加，差异不明显。说明多糖中的大部分游离蛋白已去除，多糖中可能存在结合蛋白而不能单独去除。

　　3.4.3 纯化后多糖含量在优化后的最佳条件下提取的多糖用硫酸-苯酚法测得其糖中多糖含量为43.48%，纯化后的多糖含量为66.43%。

　　4 结论

　　在提取水溶性多糖过程中，因素水平对五味子多糖得率的影响顺序为温度＞固液比＞提取时间。多糖提取的最佳工艺条件为固液比为1∶30，温度为90℃，提取时间为4 h，提取3次。

　　用硫酸－苯酚法测定多糖含量，加硫酸后立即摇匀，室温静置15 min,30℃放置水浴15 min。在486 nm下测其吸光度。显色稳定，标准曲线的相关系数为0.999 6。

　　通过测定提取多糖中的多糖含量换算出五味子试样中多糖得率的方法来指示各因素提取多糖的多寡，比用单纯的质量比考察各因素的结果更具可信性。

　　通过活性炭与sevage法联合使用纯化多糖，使提取的多糖纯度由43.48％提高到66.43％。

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