楤木皂苷抗肿瘤活性研究

作者：任美萍，刘明华，陈怡，肖顺汉， 李华，章卓

【摘要】 　　目的研究楤木皂苷的体内外抗肿瘤作用。方法以人红白血病细胞株k562、人肝癌细胞株hepg2、人结肠癌细胞株lovo和人乳腺癌细胞株mda-mb-231为模型，采用cell counting kit-8 (cck-8)检测楤木皂苷的体外抗肿瘤活性；以小鼠肝癌h22和小鼠肉瘤s180为移植性肿瘤模型，检测楤木皂苷的体内抗肿瘤活性。结果楤木皂苷可抑制k562、hepg2，lovo和mda-mb-231的增殖，其ic50值分别为（209.10±32.69），（273.30±20.40），（293.60±5.85），（329.67±26.42） mg · l-1，均大于30 mg · l-1；在50，100 mg·kg-1时，楤木皂苷对小鼠肝癌h22的抑瘤率分别为28.8%，47.06%，对小鼠肉瘤s180的抑瘤率分别为27.94%，54.92%。结论楤木皂苷体外抗肿瘤活性弱，但体内抗肿瘤活性较强。

【关键词】 楤木皂苷； 抗肿瘤； cck-8； h22； s180

　　abstract：objectiveto study the antitumor activity of aralia saponins in vitro and in vivo. methodsthe cytotoxicity of aralia saponins on human leukemia k562, hepatoma carcinoma hepg2，human colorectal carcinoma lovo and mammary adenocarcinoma mda-mb-231 were determined by cell counting kit-8 (cck-8) assay. the inhibitory effect of aralia saponins on tumor growth was observed by the models of hepatoma 22 (h22) and implanted sarcoma 180 (s180) in mice. resultsaralia saponins inhibited the proliferation of k562 , hepg2, lovo and mda-mb-231cells，the ic50 values were 209.10±32.69,273.30±20.40,293.60±5.85,329.67±26.42 mg · l-1, respectively, above 30 mg · l-1. at doses of 50,100 mg · kg-1，the inhibitory rates of aralia saponins on h22 and s180 were 28.8%, 47.06% and 27.94%, 54.92%, sionaralia saponins has a little antitumor activity in vitro, but significantly exhibits antitumor activity in vivo .

　　key words：aralia saponins； antitumor； cck-8； h22； s180

　　五加科楤木属植物，其味苦、辛，性平，常以根皮入药，具有活血化淤、祛风行气、镇痛消炎、健胃利尿、清热解毒之功效［1～3］。Www.lw881.com已有研究表明楤木皂苷具有明显的抗肿瘤活性和提高免疫功能的作用［4］。本研究对楤木皂苷进行了体内外抗肿瘤作用的初步研究，旨在为楤木皂苷在临床肿瘤治疗中的应用提供实验依据。

　　1 材料与仪器

　　1.1 药品与试剂

　　楤木皂苷由泸州医学院药物研究所提供，临用前用生理盐水配制并稀释；顺铂（ddp）注射液：云南个旧生物药业有限公司，批号：070601。rpmi1640培养基：gibco公司产品；胎牛血清：天津灏洋生物制品科技责任有限公司；cck-8(cell counting kit-8)：碧云天生物技术研究所。

　　1.2 细胞株和瘤株

　　人红白血病细胞株k562、人肝癌细胞株hepg2、人结肠癌细胞株lovo和人乳腺癌细胞株mda-mb-231均引自四川大学华西医学中心，采用含10%胎牛血清的rpmi1640 ph 7.4的完全培养基，在37℃，5% co2条件下常规培养。小鼠肝癌h22和小鼠肉瘤s180，引自四川大学华西医学中心。

　　1.3 动物

　　昆明种小鼠，18～22 g，雌性，由泸州医学院动物实验中心提供，合格证号：川实动证第17号。

　　1.4 仪器

　　酶标仪：北京普朗新技术有限公司，型号：dnm-9602；倒置相差显微镜：日本olympus公司，型号：ckx41；co2培养箱：日本sanyo公司，型号：mco-15a；dnm-9602；电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司，型号：fa1104n；离心机：北京医用离心机厂，型号：lg10-3a。

　　2 方法

　　2.1 cck-8检测楤木皂苷对人癌细胞增殖的抑制作用

　　分别取对数生长期的k562、hepg2、lovo和mda-mb-231细胞，0.25﹪胰酶制成单个细胞悬液，细胞浓度为1×108/l,接种于96孔板，每孔90 μl，悬浮细胞k562接种后立即加药，其它贴壁细胞培养24 h待其贴壁后加药。每孔加药10 μl，每个浓度3个复孔，楤木皂苷终浓度分别为31.25，62.5，125，250，500 mg · l-1，阴性组加等体积无血清rpmi1640，继续培养48 h，每孔加入cck-8 10 μl继续培养1 h，酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度a值，按下列公式计算抑制率。细胞增殖抑制率%=［1-（ a给药组-a空白孔）/（ a阴性对照组-a空白孔）］×100﹪，logit法计算半数抑制浓度（ic50）。

　　2.2 楤木皂苷对小鼠移植性肿瘤生长的抑制作用

　　参考文献方法［5］，选接种8 d健康状况良好的h22，s180瘤源小鼠，腹部皮肤消毒后，注射器抽取腹水，离心后弃上清，无菌生理盐水稀释至细胞浓度为1×1010/l，，每只小鼠右侧腋部皮下接种0.2 ml以形成实体瘤。次日将小鼠随机分为4组，每组10只，分别为模型组（生理盐水）、阳性对照组（ddp，1 mg · kg-1）、楤木皂苷低剂量组（50 mg · kg-1）、楤木皂苷高剂量组（100 mg · kg-1）。ddp腹腔注射给药，其余均为灌胃给药，1次/d，连续给药10 d。参考文献方法［5］，模型组中20％小鼠的肿瘤小于400 mg或平均重量小于1mg，均为肿瘤生长不良的表现，实验资料应作废，本实验无上述情况，造模成功。末次给药24 h后颈椎脱臼处死小鼠，称体重，计算体重差（结束体重-开始体重），剥取瘤块、脾脏和胸腺并称重，按照下列公式计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数。抑瘤率(%)＝（1-模型组平均瘤重/实验组平均瘤重）×100％，脾（胸腺）指数＝［脾（胸腺）重量（mg）/体质量（g）］×10。

　　3 结果

　　3.1 楤木皂苷对人癌细胞增殖的抑制作用

　　楤木皂苷可在较高浓度时抑制多种人癌细胞的增殖，对k562，hepg2，lovo和mda-mb-231细胞的ic50分别为（209.1±32.69），（273.3±20.4），（293.6±5.85），（329.67±26.42） mg · l-1，均大于30 mg · l-1，揭示其体外抗肿瘤活性不强。浓度-抑制率曲线见图1。

　　3.2 楤木皂苷对小鼠移植性肿瘤生长的抑制作用

　　楤木皂苷能明显抑制小鼠肝癌h22和小鼠肉瘤s180的生长，显示出较强的体内抗瘤活性，与模型组比较差异有统计学意义（p＜0.01或p＜0.05）。楤木皂苷不降低荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数，与模型组比较差异无统计学意义。楤木皂苷可提高荷瘤小鼠的体重，与生理盐水组比较差异无统计学意义。结果见表1～2。表1 楤木皂苷对小鼠移植性肿瘤h22生长的抑制作用，表2 楤木皂苷对小鼠移植性肿瘤s180生长的抑制作用（略）。

　　4 讨论

　　恶性肿瘤病人的死亡率近年呈逐渐上升的趋势。肿瘤防治研究不断进展，治疗肿瘤的方法日益增多，而传统的化疗药物毒副作用大，抑制免疫功能，使病人难以耐受，造成化疗失败。从天然产物中发现的抗肿瘤活性物质具有作用广泛，降低化疗不良反应和提高机体免疫功能等特性，对过去化疗效果欠佳的肿瘤有较好的疗效［6］。

　　楤木根土称三通花根，箭当树根，以根皮常用，味辛，微苦，性平，归肝、肾经，具祛风除湿、健脾利水、利尿消肿、活血散瘀、镇痛消炎、接骨、健胃之功效，用于治疗急慢性肝炎、脾阳虚衰之水湿停滞、肝硬化腹水、肾炎水肿、淋巴结炎、消渴、胃痛腹泻、跌打损伤、骨折、风湿痛、白带、淋病、雪崩、瘰疬、肿瘤等［7］。

　　本实验结果显示，楤木皂苷有一定的抑制人癌细胞增殖的作用，但活性不强，（ic50在209.1～329.67 mg · l-1之间）。楤木皂苷灌胃给药，对小鼠移植性肿瘤h22和s180的生长有一定的抑制作用，且随药物浓度增加抑瘤率增加，抑瘤率虽不及阳性对照组（ddp），但楤木皂苷各剂量组并不降低小鼠的免疫功能，给药后小鼠一般状态良好，体重有所增加。从实验结果分析，考虑楤木皂苷的抑瘤效应可能是通过机体免疫系统而发挥作用。楤木皂苷是楤木根的有效成分，在抑制肿瘤生长的同时可提高机体免疫功能，增强机体自身的抗肿瘤能力，具有良好的开发前景，有待今后进一步深入研究。

【参考文献】
　　［1］宋少江，李丽，马志强，等．hplc法测定辽东楤木根皮中楤木皂苷c的含量［j］．沈阳药科大学学报，2006，23（3）：162．

　　［2］朱敏英．超临界co2萃取棘茎楤木根皮挥发油的实验研究［j］．安徽医药，2005，9（7）：491．

　　［3］裘名宜，冯龙飞．黄毛楤木皂苷的抗衰老作用研究［j］．时珍国医国药，2006，17（12）：2480．

　　［4］张芳红，郭红云，谢明仁．白背楤木皂苷对hep和s180荷瘤小鼠抑制作用的实验［j］．中医康复研究，2005，9（6）：162．

　　［5］徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学，第3版［m］．北京：人民卫生出版社，2005：1757.

　　［6］李妍妍．生物碱抗肿瘤研究进展［j］．中成药，2008，30（6）：907．

　　［7］王忠壮，胡晋红．楤木属植物的生物学研究及应用，第1版［m］．上海：第二军医大学出版社，2001：8．