川芎内生真菌种群稳定性研究

【摘要】 目的探讨四川产区川芎内生真菌种群组成情况。方法采用纯培养法对川芎根茎中的内生真菌进行分类鉴定。结果从4个产地的川芎中共分离得到内生真菌64株，经显微鉴定为1纲、3目、4科、17属；两年分离的内生真菌共有7个，其菌株数量占总菌株数的81.3%。结论四川产区川芎内生真菌种群结构基本稳定。

【关键词】 川芎； 内生真菌； 种群稳定性

　　abstract：objectiveto study the endophytic fungal population stability in ligusticum chuanxiong hort.. methodsthe endophytic fungi in the rhizoma of ligusticum chuanxiong hort. from different habitats were seperated and identified by axenical cultivation method .results64 strains of endophytic fungi were isolated from the rhizoma of ligusticum chuanxiong hort. and morphologically identified to belong to 17 genera，4 families，3 orders and 1 class. conclusionthe endophytic fungal population in ligusticum chuanxiong hort. is basically stable.

　　key words：ligusticum chuanxiong hort.； endophytic fungi； population stability

川芎为伞形科植物川芎ligusticum chuanxiong hort.的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛功效。川芎自宋代以来就是著名的川产道地药材，主产于四川都江堰市（灌县）金马河上游以西地区［1］ 。内生真菌指那些其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物没有引起明显病害症状的微生物［2］。已有的研究表明，内生真菌在植物自然界中广泛存在，它们同植物的产区具有一定的联系，不同产地的同一种药用植物中内生真菌的种群结构存在较大的区别［3］，由于生长环境的不同表现出药用植物内生真菌具有地域性的特征。因此，笔者对四川道地产区的4个产地川芎的内生真菌进行分离鉴定，探讨内生真菌种群结构组成的稳定性，旨在为其品质评价提供理论数据。

　　1 材料

　　1.1 来源2006年和2007年的5～8月份分别在四川彭州敖平、四川都江堰石羊、四川彭州小鱼洞、四川阿坝汶川这4个产地采集健康植株的根茎，原植物经鉴定为川芎ligusticum chuanxiong hort.。

　　1.2 培养基pda培养基［4］

　　（马铃薯葡糖糖培养基）＋青链霉素混合液［5］（用于分离）；pda培养基；促孢培养基（kh2po4 1g，kno3 1g，mgso4.7h2o 0.5 g，kcl 0.5 g，淀粉0.2 g，葡萄糖 0.2 g，蔗糖 0.2 g，琼脂15～20 g，蒸馏水 1 000 ml，ph自然)。

　　2 方法

　　2.1 内生真菌的分离

　　从每个产地样品中挑选新鲜川芎根茎20个，先去掉须根，用自来水洗净川芎根茎表面，用5%的naclo溶液浸泡5min，然后用自来水反复地漂洗，稍干后切成适宜大小的小块，在无菌的条件下，用75％酒精中浸泡3～5 min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干，然后用无菌刀片将表皮削去，分别切成5 mm×5 mm×1 mm的小块,种植于pda培养基内，置25～28℃恒温箱中培养3～15 d，观察到培养基上从各植物组织块内部向周围长出菌丝并渐渐形成菌落时，采用尖端菌丝挑取法把真菌转移到另一个pda的试管斜面或者平皿纯化培养，即得内生真菌。

　　2.2 内生真菌的鉴定

　　采用插片培养法和点植法培养内生真菌，利用光学显微镜对分离获得的川芎内生真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定。分类检索参照文献［6，7］。

　　3 结果

　　3.1 川芎内生真菌种群多样性分析 2006年和2007年一共从4个产地的川芎中分离得到64株内生真菌，经显微形态观察，鉴定为1纲、3目、4科、17属，显示了川芎内生真菌在种类上具有丰富的多样性。川芎内生真菌的组成见表1、2，部分属种代表性显微特征见图1～4 。表1 2006年川芎内生真菌种群结构株（略）

由表1 可知，2006年分离得到的27株内生真菌属于1纲、3目、4科、11属。丛梗孢目所包括的属种类和菌株数最多。在属的水平上，头孢霉属（cephalosporium）、拟小卵孢属（ovulariopsis ）、镰孢属（fusarium)、曲霉属（aspergillus）为优势种群，包含菌株分别占总菌株数的25.9%，14.8%，14.8%，14.8%。表2 2006年4个产地川芎内生真菌种群分布情况株（略）表3 2007年川芎内生真菌种群结构株（略）

由表3知，2007年从川芎中共分离得到内生真菌37株，较2006年分离的内生真菌多，初步鉴定为3目、4科、12属。内生真菌大多属于丛梗孢目，在属的水平上，拟小卵孢属（ovulariopsis）、镰孢属（fusarium）、头孢霉属（cephalosporium）这3个为优势种属，所占比例分别为24.3％，16.2％，16.2％。

　　由表2、表4可知，不同产地川芎中分离得到了一定数量、不同类群的内生真菌。各个产地含有特有种群，表明内生真菌在属的水平上具有专一性。对于同一产地，两年分离得到的川芎内生真菌在类群、数量、分布上存在一定差异，是否与生长环境、前茬作物、有无使用农药、肥料等因素有关，有待进一步研究。表4 2007年川芎内生真菌种群分布情况株（略）

　　3.2 川芎内生真菌种群结构稳定性分析

　　从两年采集的4个产地川芎中，分离得到的内生真菌在目、科、属水平上的分布情况相似（见表1～2）。在内生真菌种群属的水平上，共有属为7个，分别是镰孢属（fusarium）、隔指孢属（dactylella ）、拟小卵孢属（ovulariopsis ）、头孢霉属（cephalosporium）、曲霉属（aspergillus）、木霉属（trichoderma）、丝核菌属（rhizoctonia），其共有属包含菌株52株，占总菌株数的81.3%。由此可见，四川产区川芎的内生真菌种群结构基本稳定。

　　4 讨论

　　本次实验是从四川产区的4个产地川芎中分离得到内生真菌64株，初步鉴定为1纲、3目、4科、17属，显示了川芎内生真菌在种类和数量上的多样性。两年分离的川芎内生真菌种群组成情况表明：川芎内生真菌在目、科、属的水平及其数量分布情况基本一致，其中丛梗孢目（moniliales）包含菌株最多，占总菌株数的92.2％；在属的分类水平上以头孢霉属（cephalosporium）、拟小卵孢属（ovulariopsis）、镰孢属(fusarium)为优势种群，包含菌株分别占总菌株数的20.3％，20.3％，15.6％，即优势种群菌株数占总量的56.3％；共有的7个属所含菌株数量占分离得到的内生真菌总数的81.3%，表明内生真菌在川芎中广泛分布，内生真菌种群结构是基本稳定的。不同产地川芎内生真菌的特有种群在种类上也较为丰富，体现植物内生真菌的种类和数量与植物所处的生长环境有密切关系。我们对甘肃产西芎、云南产云芎的内生真菌也进行了分离鉴定，种群结构与四川产的有一定的差别，在今后研究采集了足够西芎、云芎样品后，将进一步对内生真菌具有地域性特征进行研究。

【参考文献】
　　［1］万德光，赵军宁.四川道地中药材志［m］.成都：四川科学技术出版社，2005：4.

　　［2］petrini o. fungal endophytes of tree leaves. in: andrews j h， hirano s s eds. microbial ecology of leaves［m］. new york: springerverlag，1991：179.

　　［3］严铸云，庞 蕾，罗 静，等.银杏内生真菌菌种的分离及鉴定［j］.华西药学杂志，2006，21(5)：425.

　　［4］沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验［m］.北京：高等教育出版社，1999：215.

　　［5］严铸云，庞 蕾，罗 静.银杏内生真菌的多样性分析［j］.华西药学杂志，2006，14(10)：425.

　　［6］魏景超.真菌鉴定手册［m］.上海：上海科学技术出版社，1979.

　　［7］h l巴尼特，b b亨特（著）.沈崇尧（译）.半知菌属图解［m］.北京：科学出版社，1977.