高速逆流色谱法提纯盐酸黄连素对粪肠球菌抑菌

　[摘要] 目的 探讨高速逆流色谱法（HSCCC）提纯黄连中盐酸黄连素对粪肠球菌体外抑菌效果的影响。 方法 选择150株临床分离的粪肠球菌株为研究对象，随机分为Ⅰ组、Ⅱ组与Ⅲ组各50株，均配制成2000～3000 cfu/ml的粪肠球菌液；将黄连制成中药煎剂，配制成浓度为1.0 g/ml的A药液；将HSCCC提纯黄连中的盐酸黄连素配制成浓度为1.0 g/ml的B药液；Ⅰ组将粪肠球菌液涂到用A药液与M-H培养基混合的培养基上，Ⅱ组将粪肠球菌液涂到用B药液与M-H培养基混合的药液培养基上，Ⅲ组将粪肠球菌液涂到M-H培养基上，上述培养基均采用环丙沙星（CIP）、红霉素（ERY）、四环素（TE）和青霉素（PEN）药敏纸观察培养基药敏情况。 结果 Ⅰ组中CIP、ERY、TE和PEN的耐药率分别为26.0%、40.0%、36.0%、20.0%；Ⅱ组中CIP、ERY、TE和PEN的耐药率分别为10.0%、26.0%、14.0%、8.0%；Ⅲ组中CIP、ERY、TE和PEN的耐药率分别为46.0%、80.0%、44.0%、26.0%。在对环丙沙星、红霉素、四环素和青霉素的耐药率方面，Ⅲ组>Ⅰ组>Ⅱ组，三组间耐药率差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 HSCCC提纯黄连中盐酸黄连素对临床分离的粪肠球菌菌株具有较强的抑菌活性，其抑菌作用比黄连煎剂强。
　　[关键词] 高速逆流色谱；药敏试验；盐酸黄连素；肠球菌；中药
　　[中图分类号] R378.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（a）-0087-02
　　肠球菌为革兰阳性厌氧菌，是院内感染的第2大病原菌，可引起呼吸道、伤口、血液等多部位感染，其中绝大多数病原体是粪肠球菌，约占80%[1]。近年来，肠球菌多重耐药严重，有文献报道，中药黄连水煎剂对肠球菌有一定的抑菌效果[2]，为探讨从中药黄连中提纯的盐酸黄连素对粪肠球菌的抑菌效果，本研究采用高速逆流色谱法（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）提纯中药黄连中黄连素，并对粪肠球菌的药物敏感性进行了分析。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　选择2009年2月～2012年12月从本院住院及门诊患者送检的尿液、痰液、血液和脓液等各类标本临床分离到的150株粪肠球菌，随机分为Ⅰ组、Ⅱ组与Ⅲ组各50株，所有菌株均剔除同一患者同一部位重复分离的粪肠球菌菌株，各类标本均按照《全国临床检验操作规程》第2版要求采集后立即送检，肠球菌的分离与鉴定采用生物梅里埃公司的API肠球菌鉴定条鉴定药敏试验，质控菌株金黄色葡萄球菌 ATCC25923和粪肠球菌 ATCC29212均购自卫生部临床检验中心，所有操作参照产品说明书进行。
　　1.2 药敏纸片
　　青霉素（Penicillin，PEN）（10 μg/片）、红霉素（Erythromycin，ERY）（15 μg/片）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）（5 μg/片）和四环素（Tetracycline，TE）（30 μg/片）均购自英国OXOID公司。
　　1.3 药液的制备
　　将中药黄连制成煎剂，并配制成浓度为1.0 g/ml的A药液；采用HSCCC提纯黄连中盐酸黄连素，HSCCC的溶剂系统为乙酸乙酯-石油醚-甲醇-水（1∶1∶1∶1），并将盐酸黄连素配制成浓度为1.0 g/ml的B药液。
　　1.4 药敏试验
　　Ⅰ组将粪肠球菌液涂到用A药液与M-H培养基混合的药液培养基上，Ⅱ组将粪肠球菌液涂到用B药液与M-H培养基混合的药液培养基上，Ⅲ组将粪肠球菌液涂到M-H培养基上。上述培养基均采用CIP、ERY、TE和PEN药敏纸观察培养基药敏情况。
　　1.5 统计学方法
　　采用SPSS 13.0统计学软件对所有数据进行分析，计数资料使用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　Ⅰ组中CIP、ERY、TE和PEN的耐药率分别为26.0%、40.0%、36.0%、20.0%；Ⅱ组中CIP、ERY、TE和PEN的耐药率分别为10.0%、26.0%、14.0%、8.0%；Ⅲ组中CIP、ERY、TE和PEN的耐药率分别为46.0%、80.0%、44.0%、26.0%；在对CIP、ERY、TE和PEN的耐药率方面，Ⅲ组>Ⅰ组>Ⅱ组，三组间差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。
　　3 讨论
　　肠球菌属肠球菌属，为革兰阳性（G+）球菌，是条件致病菌，常引起腹腔感染、盆腔感染、尿路感染、皮肤软组织感染、败血症、心内膜炎和脑膜炎等，还可危及生命。由于肠球菌的固有耐药和获得性耐药，如高浓度的氨基糖苷类、β-内酰胺类、糖肽类、红霉素、克林霉素、利福平等，使许多常用抗菌药物在治疗肠球菌感染时失败，给临床治疗带来很大困难，极易引起院内感染的暴发流行[3]。
　　HSCCC是20世纪80年代由美国Ito博士研发的一种新型的液-液分配色谱。近年来，国内外对HSCCC的研究越来越多，应用也越来越广，如用于天然药用植物活性成分的分离及标准品制备、快速分离和重要指纹图谱分析、天然新药的研发和筛选等。可见，HSCCC技术在天然产物分离中有着广泛的应用[4-5]。
　　盐酸黄连素又称盐酸小檗碱（C20H18ClNO4·2H2O），是一种重要的生物碱，在我国应用历史悠久，可从中药黄连、黄柏、三颗针等植物中提取，它具有显著的抑菌作用，能对抗病原微生物，对多种细菌如志贺菌、结核杆菌、肺炎球菌、伤寒杆菌及白喉杆菌等都有抑制作用，尤其对志贺菌的作用最强，临床主要用于治疗细菌性痢疾和肠胃炎等消化道疾病，无耐药性和副作用。
　　有研究表明，黄连中盐酸黄连素对粪肠球菌有一定的抗菌活性，并且协同粪肠球菌降低对CIP、ERY、TE和PEN的耐药率，特别是经过HSCCC提纯后的盐酸黄连素，对粪肠球菌具有高度的抗菌活性，因为经过HSCCC提纯后的盐酸黄连素不仅提高了盐酸黄连素的浓度，而且进一步清除了盐酸黄连素抑制物质。纯化的盐酸黄连素能进一步增强抑制细菌糖代谢中间环节丙酮酸的氧化脱羧功能，抑制细菌对维生素B的利用，使抑制细菌DNA的复制功能得到强化，从而干扰细菌的生长繁殖[6-7]。盐酸黄连素可以降低肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、干扰素γ、C反应蛋白、结合珠蛋白等的水平，增加白细胞介素10等抗感染因子的表达，从而发挥抗感染效应[8-9]。CIP、ERY、TE和PEN作用于粪肠球菌细胞壁，侵入破坏核糖体，以达到抑菌和杀菌的作用[10]，纯化的盐酸黄连素能与CIP、ERY、TE和PEN相互协同作用，从而增强抗菌能力。故HSCCC提纯黄连中黄连素对临床分离的粪肠球菌菌株具有较强的抑菌活性，其抑菌作用比采用中药黄连制成的煎剂强。
　　[参考文献]
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