高效液相色谱法测定五味子甲素含量

摘　要：目的 建立五味子果实中五味子甲素含量的高效液相色谱测定方法。方法 样品用超声提取，过滤，取续滤液，采用高效液相色谱法直接测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，甲醇 -四氢呋喃 -水 (70：4：26)为流动相，进样量10μL,流速为lmL／min，检测波长为254nm进行检测。结果 五味子甲素的线性范围为0．125～1．25μg，R2为0．9992，平均加样回收率为99.2％，RSD为1.1％（n=6）。结论 此方法准确度较高，可用于测定五味子中五味子甲素的含量，为五味子生药及成品药中五味子甲素含量测定提供了一种切实可行的方法。

关键词：五味子果实；高效液相色谱法；五味子甲素

　　五味子属木兰科木质藤本植物。因其果实具甘、酸、辛、苦、咸五味而得名。分布于我东北及华北地区．是长白山地区大宗道地药材^[1]。其药用部位为果实，主要含有木脂素类成分，被奉为《神农本草经》中上品,具有保肝、降酶、保护中枢神经系统、抗艾滋病毒、抗癌等多种药理活性，现代医学将五味子主要应用于肝病及神经衰弱的临床治疗^[2]。本文采用高效液相色谱法(HPLC)测定了五味子中五味子甲素的含量,为合理开发利用五味子资源提供了质量评价手段。
　　1、材料与方法
　　1.1 仪器与试剂
　　LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津)配紫外检测器；KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);AB104型电子天平,瑞士生产;恒温水浴锅,河北黄骅生产; Kromasil C18色谱柱(4.6mm×25cm,5μm),KYATECH Corporation。
　　五味子甲素标准品(批号：080424,050512,080525)，购于中国药品生物制品检定所；水为双蒸馏水，自制；五味子购于长白山新宾林业局；其它试剂均为分析纯。
　　1.2  方法
　　1.2.1 色谱条件  
　　Kromasil C18柱(250mm*4.6mm，5μm)；流动相为甲醇 -四氢呋喃 -水 (70：4：26)；流速1.0mL／min；检测波长254nm；柱温为室温；进样量10μL。灵敏度：0.05AUFS。按以上色谱条件测定，五味子甲素峰与其他杂质峰得到很好的分离，分离度大于2.0。理论塔板数按五味子甲素计算不低于3000^[3]。
　　1.2 .2 标准品溶液的制备
　　取经80℃干燥至恒重的五味子甲素对照品1.25mg，精确称量，置25mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得五味子甲素对照品溶液(0.05mg／mL)，备用。
　　1.2.3  样品溶液的制备
　　五味子干燥、粉碎 (40～60目 ) ,精密称取 1g左右 ,用甲醇以液固比 1：15的比例 ,超声波提取 30min, 静置待冷(约lh)，吸取上清液。残渣用甲醇洗涤，过滤，共3次,合并滤液 , 加甲醇溶解并稀释定容于 50mL容量瓶中，备用。
　　1.2.4  样品测定方法
　　用五味子甲素对照品不同的进样量，按仪器的色谱条件进行实验， 得到标准色谱图，并做峰面积与含量之间的标准工作曲线。而供试品溶液和阴性溶液直接取用，与标准色谱图相同条件进行实验，得到色谱图。根据保留时间和峰面积与标准工作曲线比较进行定性和定量分析^[4]。 
　　2、结果
　　2.1  线性关系考察
　　精密吸取已经准备好的五味子甲素对照品溶液(0.05mg／mL)各2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0μl进样测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标X，峰面积积分值为纵坐标Y，得回归方程如下：
五味子甲素：Y = 17977X + 39813,相关系数: r= 0.9992
结果表明，五味子甲素在0.125～1.25μg间有良好的线性关系。 结果见表1

                 　　　　　　　　　图1 五味子甲素标准品高效液相色谱图
　　2.2   精密度试验
　　取五味子甲素对照品溶液10μL，重复进样5次，测定峰面积，其RSD为1.02％，表明精密度良好。
　　2. 3　重现性试验
　　在以上 HPLC条件下 ,取同一批次样品溶液（080525）5份 ,进行分析 ,结果测定五味子甲素的平均含量为1.026mg/g，相对标准偏差为 1 . 49%。相对标准偏差小、实验结果重复性较好 ,表明用 HPLC方法分析五味子甲素的定量分析方法准确可靠。
　　2. 4　 样品含量测定
　　在检测波长为 254nm,流动相为甲醇 -四氢呋喃 -水 (70：4：26) ,进样量 10μL,流速 1mL /min条件下 ,进行检测 ,测得五味子甲素峰面积值 ,由线性回归方程计算出五味子中五味子甲素的含量。样品测定结果见表2

　     长白山新宾林业局产的三种批号的五味子中五味子甲素的含量分别为 1.023mg/g、1.032 mg/g、1.026 mg/g。
　　2. 5　 加样回收率试验
　　分别精密量取已知五味子甲素浓度的 1.0mL提取液6份 ,分别加入一定量的五味子甲素标准品 ,按样品含量测定项下的方法进行计算五味子甲素含量 ,根据回收率公式计算出加样回收率。回收率 =（混合后测得含量 -样品中五味子甲素含量）/五味子甲素标准品加入量 × 100%^[5]，以五味子甲素标准品为对照品 ,五味子甲素加样回收率为99.2% ,相对标准偏差为 1.1% ,回收率较高 ,偏差较小 ,所以本方法准确度较高。结果见表3

　　3、讨论
　　五味子甲素为五味子的重要有效成分。现代药理学表明，五味子甲素有明显的安定和抗惊厥等生理活性，且对大脑皮层的兴奋抑制过程有调节作用^[6]。
　　为了有效地控制该制剂的质量，保证临床用药的疗效稳定、安全可靠，本文在参考文献的基础上，采相高效液相色谱法，以五味子甲素为指标，测定五味子果实中五味子甲素的含量^[7]。经方法学考察，本法灵敏度高，操作简便，结果准确，重复性好，可用于五味子相关制药的质量控制。
　　为选取相对较好的色谱条件，本次研究采用紫外分光光度法，在200-700nm波长范围内进行对照品溶液的扫描，结果五味子甲素在254nm波长处有最大吸收，故以此为检测波长，以提高检测的灵敏度。曾考察了甲醇:水、乙腈:水、甲醇：四氢呋喃：水(70：4：26)的流动相，结果以甲醇：四氢呋喃：水为流动相时，五味子甲素的色谱峰较好；此外还考察了流动相比例，结果以70：4：26的分离效果最理想，故选择甲醇：四氢呋喃：水(70：4：26)为流动相^[8,9]。
　　KromasilC18柱(250mm*4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-四氢呋喃-水(70：4：26)；流速1.0mL／min；检测波长254nm；柱温为室温；进样量10μL。灵敏度：0.05AUFS。按以上色谱条件测定，五味子甲素峰与其他杂质峰得到很好的分离，分离度大于2.0。理论塔板数按五味子甲素计算不低于3000。
　　高效液相色谱法准确度较高，可用于测定五味子中五味子甲素的含量，为五味子生药及成品药中五味子甲素含量测定提供了一种切实可行的方法^[10]。

参考文献
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[2]杨晓玲,李爱民.五味子研究概况[J].时珍国医国药,1999,10(4):300-301.
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[5]童玉懿,黎莲娘.北五味子种子有效成分的含量测定[J].中草药通迅,1977,10:8-11.
[6]刘继永,王英平,刘洪章．五味子化学成分及药理研究进展[J]．特产研究,2005,3：49．
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[10]白淑芳,陈虹,李灵芝;HPLC法测定华中五味子中五味子甲素含量[J];天津药学;2001年03期