p16基因与肝癌的研究近况

　　肿瘤发生的最重要原因是细胞增殖失控，这表明调节细胞周期的分子机制参与肿瘤的发生[1]。细胞周期的运行主要依靠一组使其进入分裂期的依赖性细胞周期蛋白激酶(cdks)的作用。cdks只有和细胞周期蛋白(cyclin)结合才能被激活，从而使细胞由g1期进入s期。同时，细胞中存在cdks的抑制因子，抑制其活性，阻止细胞分裂。近年来发现的cdk抑制分子(cdk inhibitor，cdi)，对细胞周期有负调节作用。p16基因是人们发现的第一个直接作用于细胞周期抑制细胞分裂的抑癌基因。p16基因编码的蛋白即p16蛋白，为cdks和cyclin结合的抑制蛋白。p16基因的改变(频繁杂合缺失、纯合缺失、突变及甲基化[1～3])可导致细胞过度分裂从而向恶性发展。p16基因的研究已成为当前肿瘤分子生物学和分子遗传学研究的热点。

　　1 p16基因的结构特性

　　1993年，serrano等[4]利用酵母双杂合蛋白相关性筛选法(yeast two-hybrid protein interaction screen)研究与cdk4作用的蛋白时，发现了p16基因，并克隆了p16的cdna。1994年，美国学者kamb[5]与noborl等[1]同时报道发现了一个新型抑癌基因――p16基因及有关p16基因的研究工作结果。应用克隆技术对46个人类恶性细胞系进行了研究，现已确定p16基因位于人第9号染色体短臂2区1带(9p21)上，全长8.5kb，由2个内含子和3个外显子组成，其5’端的126bp编码外显子1，中间部分的307bp编码外显子2，3’端的11bp编码外显子3[5]。编码一种分子量为15845da的核酸蛋白p16。该蛋白包含一个148个氨基酸的开放阅读框架，并由4个回钩状重复序列组成其空间构型蛋白质结构，这一构型为维持其活性所必需，主要由外显子2编码。p16蛋白n端含有与cyclin box具有同源性的序列，即mx3adwlatx4rveevx2ll序列。p16mbna有α型和β型两种不同的形态,其中α型与广泛进行研究的p16cdna基因克隆是完全一致的，β型p16mrna的转录模板第1外显子序列(e1β)与α型(e1α)不同，第2和第3外显子与α型p16cdna序列完全一致。α和β两种不同的p16mrna可能是由两种不同的启动子转录而来的。

　　p16与cdk4有高度亲和性。还能抑制与cdk4结构相似的另一个酶cdk6。近年来，人们发现有关基因在多种类型恶性肿瘤中存在基因纯合缺失或突变，从而证实了它是一个多重肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，mts1)[4，5]。大量深入的研究显示，p16基因表达异常在某些原发肿瘤中较多见，如星形细胞瘤、黑色素瘤、白血病、胰腺癌、食管癌等;但在某些肿瘤中却较罕见，如乳腺癌、大肠癌等[3];这可能涉及到不同肿瘤的发病机制。

　　2 p16基因的功能及作用机制

　　将p16基因cdna表达载体转染肿瘤细胞，结果发现可以抑制肿瘤细胞克隆形成，而且有p16基因表达的肿瘤细胞其体外继续传代受到抑制[4]。jin等[6]将野生型p16基因连接于一个腺病毒衍生的基因转移系统，并将其导入无p16基因表达的肺癌细胞系中，结果证实导入的p16基因的表达可阻止肿瘤细胞进入s期，并抑制肿瘤细胞体内及体外的增殖。应用基因转移技术研究了p16基因生长抑制功能，发现将全长p16基因cdna导入无p16基因的人类胶质瘤细胞中可显著抑制其生长;但对于有内在的野生型p16基因的细胞无明显作用。可见p16基因的蛋白产物具有生长抑制功能。

　　真核细胞的分裂周期是由细胞周期蛋白依赖性家族所调节，其中g1-s和g2-m转换是最重要的两个关卡。这个家族中各成员的连续激活和随之产生的各种关键底物的磷酸化推动细胞周期的有序进行。不同的细胞周期蛋白cdk复合物可以在细胞周期的特异位点组装起来，细胞周期蛋白d与cdk4、cdk6有特殊的亲和性，其形成的复合物使细胞内的rb磷酸化，促进转录因子产生，使细胞由g1期进入s期。p16的主要作用在于能够抑制cdk4/cdk6介导的rb基因蛋白产物的磷酸化。非磷酸化的rb可结合到转录因子e2f-dna复合物上，在启动子上阻断mrna的转录，同时又可活化转录因子atf-2，促进细胞分裂抑制因子的转录;磷酸化的rb则无此活性。在g1期，cyclind-cdk4复合物具有激酶活性，促进rb的磷酸化，而与p16与cyclind竞争结合cdk4，从而抑制rb磷酸化，阻止细胞从g1期进入s期而被阻滞于g1晚期。正常情况下，g1期cdk活性的增加使rb失活，进而导致e2f的过度表达;而后者反过来抑制cdk活性，并诱导p16相关的转录活动。因此，p16与cdk4、cyclind、rb、eif形成一个反馈调节环路。p16基因的任何变异都会导致上述环路无限制地进行，从而引起细胞的过度增殖[1，4～6]而诱发癌症的发生。

　　3 p16基因对肿瘤发生中的影响

　　3.1 p16基因的失活机制 目前大多数研究中，p16基因蛋白的失活被认为主要与p16基因本身的缺失、点突变及重组有关，其中p16基因的纯合性缺失是其正常功能丢失的主要方式，但nishikawa等[7]发现，在dna测序证明是野生型p16基因的病例中，50%未能检测到p16蛋白，因此肯定存在p16基因突变以外的失活机制使其功能产物丧失活性。有研究检测了来源于不同肿瘤类型的29例肿瘤细胞株，发现共有26例无法检出p16蛋白，而其相应基因的纯合性缺失却只占18%，点突变也仅有22%。还有研究发现[8]，p16蛋白失活机制与p16基因5’端cpg环岛的甲基化作用有关。约20%的原发肿瘤存在p16基因5’端cpg环岛的甲基化现象，而正常组织则无此现象。另外，还有研究证实，p16基因失活与rb及cdk4的改变有关。sakaguchi等[9]通过免疫组化研究了61例nsclc标本，rb阳性者均未测到p16蛋白，而rb阴性的则有p16高表达，即p16蛋白与rb的量呈负相关。he等[10]探讨了胶质瘤中cdk4与p16基因之间的关系，发现cdk4过度表达导致p16基因纯合缺失，提示二者之间存在一定的调控关系。

　　3.2 p16基因蛋白异常表达的意义 p16基因是新发现的一种抑癌基因，它的突变和缺失广泛存在于各种肿瘤中，自1994年以来，研究逐渐兴起。okamoto等[8]报道在人肺、食管、肝、结肠和胰腺的肿瘤细胞中明显的p16基因的表达与cyclind的表达相反，因p16基因的cdna表达载体转染进入癌细胞可有效抑制癌细胞克隆形成。反之，p16的缺失则导致肿瘤细胞无限制生长。还有在食管癌、乳腺癌、白血病等研究中，均发现有p16基因高频率纯合缺失或突变，说明p16基因功能的失活与肿瘤的起因和恶化有关，需进行更广泛的研究。p16基因与肺癌的关系亦有不少报道。shimizu等应用pcr-sscp方法检测30例原发性肺癌标本，其杂合丢失发生率为50%，突变率占7%，说明在某些原发性肺癌的发生、发展中p16基因起一定作用。

　　4 p16基因与肝癌

　　4.1 p16基因在hcc的变异 肝癌是消化系统比较常见的恶性肿瘤，发病率逐年增高，预后较差。分子生物学研究显示，肝细胞癌的发生与癌基因的异常激活及抑癌基因的失活密切相关。迄今已有一些报道。国内外对p16基因在hcc中的表达及基因变异研究较少，且存在分歧。1995年kitagawa等[11]对小鼠hcc用微卫星探针进行共显性分析，在源肿瘤中未发现明显p16基因畸变，但hcc源的细胞系中第4号染色体杂合性丢失(loss of heterozygosity，loh)发生率很高(95%)，提示基因功能丢失很可能包括p16基因。hui等[12]检测了6个hcc细胞系和32例原发hcc的p16基因状况，分别在蛋白水平采用wester blot，在mrna水平用rt-pcr和northern blot，在基因水平用southern blot和pcr-sscp分析法检测p16基因，发现在50%的细胞系，34%的原发hcc中p16蛋白表达缺失，但在癌旁组织存在p16蛋白，提示p16基因的失活与hcc密切相关。hui等还发现在hcc细胞系和原发肿瘤中既没有p16基因的纯合子缺失和突变，也没有p16mrna表达的丢失，认为hcc中p16基因的失活主要是由于转录后的调节而不是基因畸变或缺少转录所致。最近，jin等[13]检测了hcc原发肿瘤及细胞系中p16基因和蛋白状况，发现30%的hcc和29%hcc细胞株有纯合性缺失，35%的hcc和43%hcc细胞株的p16启动子区域存在过度甲基化，认为在9p21基因位点编码的细胞周期调节蛋白中，hcc最常发生p16基因的失活，其中启动子过度甲基化和纯合性缺失是常见的失活机制。

　　但有些研究结果则相反，biden等[14]用loh分析法、pcr、sscp分析法和dna序列分析澳大利亚23例原发hcc病例和4个hcc细胞系，均未发现p15、p16基因畸变，而在p16基因位点的邻近区域发现两处(dpsl604和dqsl71)缺失，发生率分别为54%和29%。sscp和dna序列分析发现4例在密码子148处有相同核苷酸的改变，其中1例在密码子119位处有突变，从而使谷氨酸转变为赖氨酸，故认为p16基因在hcc很少发生缺失或突变，这可能与人种不同及hcc病因不同有关。另外，p16基因上游共显性基因丢失可导致此基因表达中调节序列的失活，在靠近p16基因区域的9p21-22区可能存在另一种肿瘤抑制基因。shen等[15]也发现只有3%(1/34)存在p16基因外显子1的纯合性缺失，亦未见p16基因突变或重排，认为hcc中很少有p16基因的改变，并且p16基因的改变在hcc的发生中很少起作用。

　　4.2 p16基因与hcc的进展、转移 许多研究发现，p16基因的异常与肿瘤的进展、转移有关，表现为恶性程度高的肿瘤及转移性肿瘤中p16基因的改变高于恶性程度低的肿瘤，如皮肤鳞癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌等。在hcc中也发现p16基因表达的失活与hcc的进展与转移密切相关。hui等[16]调查发现44%的hcc存在p16蛋白缺失，在转移灶中p16蛋白缺失的比例(74%)是原发灶(36%)的2倍，且p16蛋白和(或)阳性蛋白的缺失与hcc的细胞低分化程度、血管侵袭和转移密切相关。王英等在研究p16基因在hcc的表达情况时发现p16基因的阳性表达率与hcc的恶性程度、自然病程密切相关。随着肿瘤恶性程度的上升，p16基因表达的阳性率明显下降，且阳性程度也下降。在低分化hcc中p16基因表达阳性率很低，认为p16基因阳性的低或无表达是hcc晚期的表现，提示p16蛋白缺失与肝癌的发生、发展，尤其是与肝癌的恶性发展关系密切，对肝癌的预后可能有重要影响。

　　5 p16应用前景

　　p16蛋白是第一个发现的具有多肿瘤抑制作用的蛋白质分子，p16基因的异常改变几乎存在于全部的恶性肿瘤中，其在多种恶性肿瘤中的异常表达与恶性肿瘤的进展和转移有关，故可望成为估测某些恶性肿瘤发展、预后的候选标志。

　　已有将p16基因导入肿瘤细胞系已获得抑制肿瘤细胞生长的效果，国内亦见有报道[17]。因此，人们都将p16基因视为肿瘤基因治疗的良好靶基因之一，这为p16基因在恶性肿瘤的基因治疗上打下了理论基础。目前只有p53基因的替代治疗进入了临床实验阶段。而p16基因较p53基因具有更大的优越性：(1)在肿瘤中的异常率高;(2)致癌机制更清晰、直接;(3)基因小分子量仅为p53基因的1/4易于标定、操作容易，抗癌作用更直接高效;(4)可特异性作用于cdk4，蛋白特异性强[18];(5)可与rb、p53等抑癌基因共同抗癌。

　　p16基因的cpg岛甲基化研究工作带来的一个重要命题是甲基化所致的表达是可逆的。cpg岛甲基化对去甲基化剂5-dazc非常敏感，而正常体细胞中受甲基化调节的基因很少，使用去甲基化剂不会引起正常组织的功能基因表达异常[3]。这项工作可能会为p16基因在肿瘤中的“复活”带来全新的方法。

　　有学者应用腺病毒载体将p16cdna导入肺癌细胞系293中得到表达，肿瘤细胞生长受到明显抑制。将wt p16转染有p16缺失的神经胶质瘤细胞，其对放射线的敏感性增加[19]。arap等用p16基因治疗肿瘤，收到一定效果。higashi等将p16cdna导入人成胶质细胞瘤得到表达，限制了细胞的无约束生长和锚着非依赖性生长[20]。将wt p16基因导入膀胱癌细胞系明显抑制了肿瘤细胞的生长。还有学者因p16基因畸变在消化系恶性肿瘤有较高发生频率。wt p16基因用于此类肿瘤的基因治疗。另外，针对p16蛋白与cdk4/6的特异结合可以开发新的“生物导弹”制剂以治疗肿瘤。为恶性肿瘤的基因治疗开辟出一个新天地。

　　寻找一种简便而又灵敏的方法，使p16基因在相关肿瘤中重新表达从而抑制肿瘤的无限制生长，这是肿瘤防治过程中的一项重要工作。

　　【参考文献】

　　1 nobori t,miura k,wu dj,et al,deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human ,1994,368:753-756.

　　2 gonzales-zulueta m,ohneseit frequency of chromosome 9p allelic loss and cdkn2 tumor supressor gene alteration in squamous cell carcinoma of the bladder.j natl cancer inst,1995,87:1383-1393.

　　3 herman jg,merlo a,mao vation of the cdkn2/p16/mts1 gene si frequently associated with aberrant dna methylation in all common human res,1995,55(20):4525-4530.

　　4 serrano met,hannon gj,beach da.a new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin ,1993,336(6465):704-708.

　　5 kamb a,gruis na,weaver-feldhaus j,et al.a cell cycle regulator potentionally involved in genese of many tumor e,1994,264(5157):436-440.

　　6 jin cycle arrest and inhibition of tumor cell proliferation by the p16ink4 by an adenovirus res,1995,55：3250-3254.

　　7 nishikawa r,furnari fb,lin h,et of p16ink4 expression is frequent in high grade res,1995,55(9):1941-1945.

　　8 okamoto a,jiang w,kim sj,et expression of human cyclin d reduce the transgorming growth factor beta(tgf-beta)typeⅱ receptor and growth inhibition by tgf-beta in an immortalized human esophageal cell natal acad sei usa,1994,24(23):11045-11049.

　　9 sakaguchi m,fujii y,hirabayashi h,et ely correlated expression of p16 and rb protein in non-small cell lung cancers: an immunohistochemical j cancer,1996,65(4):442-444.

　　10 he j,allen jr,collins vp,et 4 amplification is an alternative mechanism to p16 gene homozygous deletion in glioma cell res,1994,54(22):5804-5808.

　　11 kitagawa t,myasaka k,kanda cacinogenesis in rodents and humans.j cancer res clin oncol,1995,121(9-10):511-515.

　　12 hui am,nishida n,fuknda vation of p16ink4 in hepatocellular logy,1996,24(3):575-579.

　　13 jin m,piao z,kim ng.p16 is a major inactivation of p16 target in hepatocellular ,2000,89(1):60-68.

　　14 biden k,young j,buttenshaw ncy of mutation and deletion of the tumor suppressor gene cdkn2a(mts1/p16) in hepatoceelular carcinoma from an australian logy,1997,25(3)：593-597.

　　15 shen lar mechanism of hepatocarcinogensis.j gastroenterol hepatol,1997,12(9-10):9309-9313.

　　16 hui am,shi yz,li of p16(ink4) protein,alone and together with loss of retinoblastoma protein,correlate with hepatocellular carcinoma lett,2000,154(1):93-99.

　　17 孙梅,吕有勇.外源性p16基因表达可抑制人胃癌细胞的恶性增殖.中华肿瘤杂志,1997,19:410-413.

　　18 marx tumor suppressor may rival e,1994,264:344-345.

　　19 miyakoshi j,kitagawa k,yamegishi n,et sed 1a diosensitivity of p16 gene-deleted human glioma cells after transfection with wild-tyre p16 j cancer res,1997,88(1)：34-38.