HIF1α和Glut1在乳腺癌中的表达及其与血管生成

【摘要】 目的 探讨hif1α、glut1在乳腺癌中的表达及其与微血管密度的关系。方法 免疫组化法检测20例癌旁组织、60例乳腺癌中hif1α、glut1表达，用cd34抗体标记乳腺癌血管内皮细胞，计算微血管密度（mvd）。结果 hif1α、glut1在乳腺癌中阳性表达分别为68.3%、63.3%，均高于对照组，差异有统计学意义(p<0.01)，两者表达呈正相关(r =0.461,p<0.001)。hif1α、glut1阳性的乳腺癌组织mvd高于阴性者，差异有统计学意义 (p<0.01)，hif1α、glut1均阳性时mvd 最大 (p<0.01)，hif1α、glut1、mvd与肿瘤临床分期、淋巴结转移密切相关(p<0.01)。结论 乳腺癌组织中hif1α、glut1呈过表达，两者在其发生、发展过程中可能具有协同作用，对肿瘤新生血管生成可能有重要作用。

【关键词】 乳腺癌；缺氧诱导因子1α；葡萄糖转运蛋白1；mvd；免疫组织化学

relationship of expression of hif1α and glut1 with angiogenesis in breast carcinoma

ma zhaosheng, zhou shifu, jin linfang,cai fenglin,shi weifeng

the fourth hospital affiliated of soochow university, wuxi 214062, chinaabstract：objective to study the relationship of the expression of hif1αand glut1 with angiogenesis in breast carcinoma,and to analyze the correlation of them. methods hif1α and glut1 protein expression were detected by immunohistochemical methods in 60 cases of breast carcinoma and 20 cases of tumor adjacent normal breast 34 marking vascular endothelialcell was used to measure the microvascular density (mvd). results the positive expression rates of hif1α and glut1 in breast carcinoma was 68.3% and 63.3%，showing a significantly difference in the expression of hif1αand glut1 between breast carcinoma and control group (p<0.01),expression of hif1αwas positively correlated with expression of glut1（r=0.461,p<0.001）.mvd in hif1α(+) or glut1(+) group was significantly higher than that in hif1α(-) or glut1(-) group (p<0.01).the mvd reached the maximum in patients whose hif1α and glut1 were both positive (p<0.01). the expression of hif1α, glut1 and mvd were significantly correlated with lymphatic metastasis and surgicalpathologic staging (p<0.01). conclusion there have overexpresion of hif1α and glut1 in breast carcinoma,they may have a synergistic effect in the genesis and development of breast carcinoma,and may play an important role in angiogenesis of breast carcinoma.

key words：breast carcinoma; hif1α;glut1;mvd; immunohistochemistry

肿瘤细胞增殖迅速，缺氧是常见现象，肿瘤细胞适应缺氧微环境的主要机制包括改善肿瘤组织的能量代谢以及诱导新血管生成等。缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor1α，hif1α)起着关键性的作用。葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1, glut1)广泛存在人体各组织，对摄取葡萄糖并参与机体能量代谢具有重要的调节作用，本研究检测乳腺组织中hif1α，glut1和微血管密度（microvasular density,mvd），研究hif1α和glut1的表达及其与血管生成、临床病理因素的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2006年9月～2007年2月经病理证实为原发性乳腺癌的改良根治术标本60例，术前均未经抗肿瘤治疗。所有标本均为浸润性乳腺癌。腋窝淋巴结转移阳性者32例，阴性者28例。另取20例癌旁组织做对照。

1.2 主要试剂 兔抗人hif1α多克隆抗体、鼠抗人cd34单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人多克隆glut1抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 实验方法 组织经10%福尔马林固定、常规石蜡包埋，4μm厚切片，分别进行he染色和免疫组化染色，兔抗人hif1α多克隆抗体工作浓度1∶40, cd34抗体、glut1抗体为即用型，采用免疫组化envision二步法，阳性照片由试剂公司提供，以pbs代替一抗作阴性对照。

1.4 染色结果判断 高倍镜下随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，共计1 000个。hif1α表达的阳性判断标准参考zhong等[1]的报道：(-)：没有染色或<1%的细胞核染色；（＋）：1%～10%的细胞核染色，和(或)较弱的胞浆染色；(++)：11%～50%的细胞核染色，和(或)明显的胞浆染色；(+++)：>50%的细胞核染色，和(或)较强的胞浆染色。glut1表达的阳性判断标准参考cooper等[2]的报道：胞浆和（或）胞膜染为棕黄色为glut1阳性细胞，(-)：无癌细胞染色，（＋）：1%～10%癌细胞染色，(++)：11%～50%癌细胞染色，(+++)：＞50%癌细胞染色。mvd测定参照牛新捷等[3]方法每张切片在100倍光镜下挑选血管分布最高区域，在200倍光镜下记数5个视野内被cd34染成棕色的血管数，取其平均值为该例肿瘤的mvd值，结果以±s表示。与临近微血管明显分开的阳性染色的血管内皮细胞或细胞簇均视为独立的微血管，管径大于8个红细胞的血管不计数。

1.5 统计学方法 用spss13.0软件进行统计学分析，用χ2检验、 spearman秩相关检验、方差分析分析相关数据。

2 结果

2.1 hif1α和glut1在乳腺组织中的表达 hif1α和glut1在乳腺癌中高表达，在癌旁组织中低表达，差异有显著性，p<0.01,见表1。

2.2 hif1α、glut1和mvd表达与临床病理因素的关系 hif1α、glut1和mvd表达与临床分期、淋巴结有无转移密切相关，p<0.05，见表2。 表1 hif1α、glut1在乳腺组织中的表达

2.3 hif1α和glut1相关性 经spearman检验，hif1α与glut1表达强度间呈正相关，r=0.461,p<0.001,见表3。表3 hif1α和glut1在乳腺癌表达之间的关系

hif1αglut1-+～+++np-11819+～+++1130410.000

2.4 hif1α、glut1表达与mvd的关系 hif1α、glut1表达阳性的乳腺癌中其mvd均明显高于其相应表达阴性者，p<0.01,见表4。表4 hif1α、glut1表达与mvd的关系

表达情况例数mvd（±s）phif1α -1922.35±4.09 +～+++4127.53±4.86＜0.01glut1 -2222.47±3.53 +～+++3825.89±5.20＜0.01

2.5 hif1α/glut1表达与mvd的关系 hif1α/glut1（+/+）组mvd显著高于hif1α/glut1（-/+）（+/-）和（-/-）组，差异有统计学意义，p<0.05。而且hif1α/glut1（/+）（+/-）组mvd也显著高于hif1α/glut1（-/-）组，p<0.05,见表5。表5 hif1α/glut1表达与mvd的关系

hif1α/glut1表达组nmvd（±s）p（-/-）*1120.60±3.51（-/+）（+/-）**1924.53±2.99＜0.01（+/+）***3028.70±5.20

q检验：*与**比较：p=0.017；**与***比较：p=0.001；*与***比较：p=0.000

表2 hif1α、glut1和mvd表达与临床病理因素的关系临床病理

3 讨论

缺氧诱导因子(hif1)是机体细胞适应缺氧应激产生的转录因子[4]，由hif1α和hif1β两个亚单位构成，其转录活性主要由hif1α的表达水平和稳定性决定的。hif1α可和不同缺氧反应基因结合，促使这些基因转录，促进肿瘤新血管的生成，维持肿瘤细胞的能量代谢，为肿瘤细胞增殖和转移提供物质基础。在一系列人类肿瘤中都有hif1α高表达，在一些癌前病变组织也可以检测到hif1α的存在，而在正常组织中无表达，本研究得到了相似结论，提示细胞缺氧发生在癌变之前，持续肿瘤发生的全过程，hif1α异常表达可能是癌变过程的早期行为。同时我们发现hif1α与乳腺癌淋巴结是否转移、临床分期有关，表明hif1α可能是高度侵袭性的一种生物标志，其可能机制为:（1）hif1α高表达诱导新生血管生成，新生血管为肿瘤组织供氧供能，同时也为癌细胞的转移提供通道；（2）hif1α表达增加，激活组织蛋白酶d、基质金属蛋白酶2、尿激酶型纤溶酶激活物受体、纤维连接素、波形蛋白、转化生长因子α、自分泌移动因子等在侵袭相关基因表达[5]，增加对肿瘤细胞基底膜、细胞外基质的降解，使细胞细胞、细胞基质间黏附力降低，侵袭性增加，最终导致细胞的分离和转移。

恶性肿瘤细胞代谢旺盛，葡萄糖利用率明显增加，而糖是水溶性物质，不能自由通过细胞膜的脂质双分子层，glut（glucose transporter）是分布在细胞膜上的一类跨膜糖蛋白，是葡萄糖跨膜转运的载体。到目前为止，已经发现有14种glut，其中glut1分布最为广泛，其主要功能是为细胞提供基本的葡萄糖供应，通过糖酵解产生的atp得以生存。因此，glut1异常表达是肿瘤缺氧的一种标志，也可能是一个病理性的细胞适应过程。文献报道在乳腺癌、膀胱癌、肾癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中glut1均有过度表达，本研究glut1在乳腺癌中表达率为63.3%，癌旁组织中低表达，表达与腋淋巴结是否转移、临床分期密切相关，推测glut1参与了恶性肿瘤的发生，可能是一个早期指标，与肿瘤的高侵袭不良预后有关。

缺氧诱导glut1表达的可能机制为在缺氧的情况下，hif1α表达急剧升高，激活glut1 5′端的增强子序列，从而引起glut1大量表达[6]，继而增加葡萄糖的转运和糖降解，有助于组织细胞对缺血、缺氧的耐受。本研究显示，41例hif1α阳性者中38例glut1阳性，表达呈正相关(r =0.461，p<0.001)。hif1α和glut1在乳腺癌组织中表达的这种相关性进一步支持了glut1受hif1α调节的学说，提示在肿瘤组织处于缺氧状态时，hif1α对调节肿瘤组织参与糖代谢的相关蛋白基因表达有重要作用。

我们发现，在hif1α、glut1阳性表达标本中mvd显著高于阴性表达组，提示hif1α、glut1高表达与乳腺癌的血管生成有关，hif1α、glut1均阳性组mvd最高，提示两者可能具有协同作用。目前认为，vegf是hif1α重要的靶向基因[7]，乏氧条件下hif1α与vegf上的缺氧反应元件（hypoxia response element，hre）序列结合，增加vegfmrna的稳定性，以及vegf的转录活性，vegf表达增加，从而诱导新生血管生成。而肿瘤生长过程中，血液供应常呈现滞后状态，肿瘤为维持高代谢状态，促进glut1高表达，通过糖酵解满足生长需要。hif1α、glut1共同表达，协同刺激血管生成，其确切机制有待进一步研究。

肿瘤细胞在缺氧的微环境中会产生一系列的生理、生化改变，增加对放化疗的抗拒性，而且使肿瘤细胞更具有侵袭性，容易发生远处转移，导致治疗失败。hif1α、glut1在其中的作用正逐渐成为研究热点，随着研究的深入，以hif1α为靶点抑制其基因表达，遏制肿瘤细胞能量代谢和血管生成，可能成为肿瘤治疗和预防的重要手段之一。

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