基因多态性与宁夏汉族乳腺癌遗传易感性研究

【摘要】 ［目的］ 分析宁夏汉族cyp1a1*2a基因多态性与乳腺癌遗传易感性的关系。［方法］ 应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（pcr-rflp）技术分别对144例乳腺癌患者和154例对照的cyp1a1*2a基因多态性进行测定，分析两组基因型及等位基因频率的分布特点。［结果］ cyp1a1*2a等位基因t、c在乳腺癌组和对照组分布的差异无显著性(p>0.05)，其中等位基因c的乳腺癌发病风险比值比（or）为1.34(95%ci：0.97～1.86)。cyp1a1*2a各基因型分布两组间差异也无显著性(p>0.05)，杂合子突变tc、纯合子突变cc分别与野生型tt相比，乳腺癌发病风险or分别为1.32(95%ci：0.80～2.18)和1.86(95%ci：0.92～3.78)。［结论］ cyp1a1*2a基因多态性其突变纯合子和杂合子有增加乳腺癌风险的趋势，但未达到显著水平。cyp1a1*2a基因多态性可能与宁夏汉族人群乳腺癌的发病有关系。

【关键词】 乳腺肿瘤

study of cyp1a1 *2a gene polymorphism and susceptibility to breast cancer in the han nationality in ningxia

guo wei-dong1, rao ning-lian2, liu chun-lian1, et al.

( first hospital affiliated ningxia med. coll, yinchuan 750004, china; first people’s hospital of ningxia, yinchuan 750021, china)

abstract: ［purpose］ to investigate the association between cyp1a1 *2a gene polymorphism and its susceptibility to breast cancer in the han nationality in ningxia. ［methods］ cyp1a1 *2a gene polymorphism in 144 cases with breast cancer and 154 controls were detected by pcr-rflp. the frequencies of genotype and allele were analyzed. ［results］ the frequencies of allele t and c showed no significant difference between the two groups (p>0.05). the odds ratio (or) of breast cancer with the allele c was 1.34(95%ci:0.97～1.86). there was no significant difference in the genotype tt, tc, cc between the two groups (p>0.05) too. compared to wild type tt, the or of breast cancer with genotypes of heterozygote tc and homozygote cc were 1.32(95%ci: 0.80～2.18) and 1.86(95%ci: 0.92～3.78), respectively. ［conclusion］ it is possible that the cyp1a1*2a gene polymorphism is linked with breast cancer in the han nationality in ningxia. homozygote and heterozygote might increase risk for breast cancer, but without significant between breast cancer and controls.

key words: breast neoplasms; cytochrome p450 1a1*2a; gene polymorphism; ningxia; han population

目前已确认的乳腺癌危险因素只能解释30%～40%的发病原因[1]。除家族性乳腺癌主要与brca1、brca2有关外，散发性乳腺癌的发生可能与环境致癌物的代谢有关。个体之间的患癌差异性被称为肿瘤遗传易感性。研究表明ⅰ相与ⅱ相代谢酶基因多态性与个体肿瘤易感性差异有关。cyp1a1是体内重要的ⅰ相代谢解毒酶之一，能代谢活化多种环境致癌物或致突变物[2]，国外报道显示其遗传多态性与乳腺癌的易感性有关[3]。本研究对144例乳腺癌患者和154例对照的细胞色素p450 1a1（cyp1a1）基因3′端*2a多态性的分析，探讨cyp1a1*2a基因多态性与宁夏汉族乳腺癌易感性的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

于2005年5月～2006年8月，收集经宁夏医学院第一附属医院临床病理检查确诊的女性乳腺癌患者144例，年龄28~75岁，平均年龄52.27岁；来自该院的健康体检女性对照者154例，年龄30~70岁，平均年龄52.69岁。所有研究对象均无乳腺炎等乳腺疾病史、无放射和化学药物治疗史、无自身免疫性疾病史；两组研究对象均为在宁夏地区生活15年以上且无血缘关系的汉族居民。以上研究对象为排除pcr扩增失败的样本。

1.2 实验方法

1.2.1 提取外周血dna

抽取静脉血3～5ml，edta抗凝，低渗溶血法分离白细胞,酚、氯仿法提取基因组dna，并用乙醇沉淀，溶解于保存液(tae)中(浓度为0.1mg/l)，置-4℃冰箱保存。

1.2.2 cyp1a1基因多态性检测

引物设计：引物[3]由北京赛百盛技术有限公司合成。上游：5′-taggagtcttgtctcatgcct-3′，下游：5′-agcggctacacctcttcactg-3′。上下游引物（各5od）分别加去离子水228.8μl及262.6μl配置成1μl/l备用。

pcr扩增：体系总体积为25μl，包括10pmol/μl的引物溶液各1.25μl，4×dntp(含各种dntp2.5mmol/l)溶液2.0μl，10×buffer 2.0μl，25mmol/l mgcl2溶液1μl，tag酶1u（购自华美生物工程公司），基因组dna溶液2.0μl，再加去离子水至25μl配成反应体系。

应用bio-rad公司的pe2400pcr仪进行基因扩增。反应条件为94℃预变性5min，循环周期依次为解链94℃35s，退火60℃35s，延伸72℃60s，33个循环周期后72℃再延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳，检查聚合酶链反应（pcr）扩增产物，扩增片段大小为343bp。pcr扩增产物置-4℃冰箱保存待用。

酶切与电泳：pcr扩增产物10μl，mspⅰ(promega) 0.5μl(10u)，10×buffer 2.0μl，bsa 2.0μl，用去离子水补足至20μl，37℃水浴，转摇40转，消化4h。2%琼脂糖凝胶电泳40min。

酶切结果经电泳后，于紫外灯下判定其基因型，cyp1a1*2a野生型（tt）显示为343bp一条带；杂合突变型（tc）为343bp、200bp、143bp三条带；纯合突变型（cc）为200bp、143bp两条带。另取tt和cc的pcr扩增样本数例送测序，检验基因分型的准确性。

1.3 统计学处理

采用spss11.5软件对所得数据进行统计分析。测得的基因型、等位基因频率与hardy-weinberg平衡的符合程度采用卡方检验。两组之间等位基因与基因型频率比较用χ2检验，p<0.05为差异有统计学意义。用or和95%ci确定cyp1a1*2a多态性与乳腺癌发病的相对危险度。

2 结 果

2.1 酶切和测序结果

经电泳后，于凝胶成像系统摄影记录，以直接计数法分别统计两组各基因型的个数。经聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（pcr-rflp）技术筛选出野生型和纯合突变型pcr的扩增产物各1例，由北京利嘉生物公司测序，见图1。

2.2 群体代表性检验

两组研究对象cyp1a1*2a基因型分布，经χ2检验，p>0.05 ,符合hardy-weinberg平衡，表明研究对象来自同一群体，具有较好的代表性。

2.3 cyp1a1*2a基因多态性分布情况

cyp1a1*2a基因多态性的分布情况及统计学检验结果见表1、表2。乳腺癌组与正常对照组cyp1a1 *2a多态位点在两组间的各基因型频率分布差异无显著性(p＞0.05)，杂合子突变tc、纯合子突变cc与野生型tt相比，患乳腺癌的危险度分别提高了1.32倍和1.86倍；两组间的等位基因频率分布差异也无统计学意义，其中等位基因c使乳腺癌发病风险增加1.34倍。

3 讨 论

cyp1a1由cyp1a1基因编码, 该基因位于染色体15q22～24，含7个外显子和6个内含子，目前已发现4个重要的多态性位点。其中等位基因cyp1a1*2a，位于cyp1a1基因3′端非翻译区，由3801t→c（多聚a位点下游约264bp）突变所引起。除野生型纯合子tt，突变型杂合子tc和突变型纯合子cc均具有mspⅰ识别的酶切位点。3种基因型在不同人群中的分布表现出较大的差异。在亚洲人群基因型cc和基因型tc频率分别是2%～18%和32%～55%，而在欧洲和美洲白种人群两种基因型的频率则分别是0～5%和9%～28%[4]。环境致癌物如多环芳烃(pahs)[5]通过胞浆内芳烃受体(ahr)介导而高度诱导cyp1a1表达。前致癌物与受体结合后，ahr与hsp90 解离，在芳烃受体核转运蛋白(ah receptor nuclear translocator，arnt)协助下进入细胞核内，ahr/arnt 复合物迅速结合于cyp1a1的5′区的外源物反应元件(xenoviotic responsive elements, xre)上，通过强有力的转录激活结构域激活cyp1a1基因的表达。cyp1a1可催化多环芳烃等环境致癌物的羟基化等反应，所形成的亲电子的中间代谢产物可与dna共价结合,形成dna与致癌物的加合物,引起癌基因与抑癌基因的突变，启动致癌或诱变过程。

本研究结果显示cyp1a1 *2a多态位点的基因型分布和等位基因频率分布在乳腺癌组与对照组之间无显著性差异。但突变等位基因c使患乳腺癌的危险度增加了1.34倍；突变基因型cc与野生型tt相比，患乳腺癌的危险度增加了1.86倍，表明cyp1a1 *2a多态性与乳腺癌易感性可能有关，突变基因型可能通过上述的机制增加了环境毒素的毒性作用，为乳腺癌发生的原因之一。目前国外对该基因多态性与乳腺癌的相关性研究较多，但结果不相一致。自从taioli等[3]1995年报道了cyp1a1 *2a多态位点与美国黑人女性乳腺癌的危险有显著关联以来，相继有近10项研究报道了该位点与乳腺癌危险的关系，在早期的研究中倾向于该位点与一些特殊人群如黑人女性、绝经妇女的乳腺癌发病关联，or值在2～9左右，且有统计学意义，但当时研究样本较小(n<200)。20世纪90年代末期美国学者bailey[6]和ishibe[7]在两项大型的乳腺癌病例对照研究中未发现cyp1a1*2a与乳腺癌关联。令众多学者困惑的是，后来在日本大阪[8]、德国和奥地利[9]的2项研究认为cyp1a1 *2a杂合子和纯合子反而对乳腺癌有保护作用，or为0.6～0.7左右，并且有统计学意义。

结合本研究结果分析，提示cyp1a1*2a基因多态性其突变纯合子和杂合子有增加乳腺癌风险的趋势，但未达到显著水平。因此cyp1a1*2a多态性在散发性乳腺癌发生、发展中的机制还有待进一步研究。只有在广泛考虑到遗传异质性作用、环境因素影响以及种族群体差异的基础上进一步扩大样本，并结合其它连锁分析方法，才能真正确定cyp1a1基因多态性与乳腺癌发生的内在联系。

【参考文献】
[1] henderson ic. risk factors for breast cancer development[j]. cancer, 1993, 71(6 suppl):2127-2140.

[2] crewe hk, notley lm, wunsch rm, et al. metabolism of tamoxifen by recombinant human cytochrome p450 enzymes: formation of the 4-hydroxy,4′-hydroxy and n-desmethyl metabolites and isomerization of trans-4-hydroxytamoxifen[j]. drug metab dispos, 2002, 30(8):869-874.

[3] taioli e,trachman j, chen x, et al. a cyp1a1 restriction fragment length polymorphism is associated with breast cancer in african-american women[j]. cancer res, 1995, 55(17):3757-3758.

[4] masson lf, sharp l, cotton sc, et al. cytochrome p450 1a1 gene polymorphisms and risk of breast cancer: a huge review[j]. am j epidemiol, 2005, 161(10):901-915.

[5] alexandie ak, warholm m, carstensen u, et al. cyp1a1 and gstm1 polymorphisms affect urinary 1-hydroxypyrene levels after pah exposure[j]. carcinogenesis, 2000, 21(4):669-676.

[6] bailey lr, roodi n, verrier cs, et al. breast cancer and cypia1, gstm1, and gstt1 polymorphisms: evidence of a lack of association in caucasians and african americans[j]. cancer res, 1998, 58(1):65-70.

[7] ishibe n,hankinson se,colditz ga, et al. cigarette smoking, cytochrome p450 1a1 polymorphisms, and breast cancer risk in the nurses’health study[j]. cancer res, 1998, 58(4):667-671.