不同相对分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯内皮细胞

　　岩藻聚糖硫酸酯（fucoidan)是一种水溶性硫酸 杂聚糖,是褐藻特有的一种化学组分。据初步的药理 研究发现1—8 ,它具备抗凝血、抗肿瘤、抗HIV、抗血栓、提高免疫力、降血脂等多种医学功效,是当今天然 海洋药物研究的重点之一。血栓形成的最主要因素 是血管受到损伤,其中首当其冲的就是血管内皮细胞的损伤5。因此,判断一种药物是否可作为理想的抗 血栓药物,也应该对其是否具有保护血管内皮细胞的 功能进行考察。有报道称,海带中提取的高分子杂多 糖对血管内皮细胞可能具有保护作用6,在作者的前 期研究中,发现中、低相对分子质量的海带岩藻聚糖 硫酸酯均具有良好的抗血栓作用&—]。而其是否对内 皮细胞具有保护作用，尚待进一步研究。本实验同时 采用体内研究和体外研究的方法,考察不同相对分子 质量海带岩藻聚糖硫酸酯对内皮细胞的保护作用，并 探讨其作用机制,为开发抗血栓新药提供理论支持。

　　1材料

    1.1 动物SD大鼠,雄性,清洁级,200 ~250 g青岛市药 检所实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK (鲁） 20090007]。

　　1.2细胞株人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endo¬thelial cell, HUVEC,上海泛柯生物科技公司）细胞 株取自人脐带静脉组织,为原代冻存细胞。

　　1.3药品与试剂4种岩藻聚糖硫酸酯（中国海洋大学食品科学 与工程学院）。相对低相对分子质量岩藻聚糖硫酸 酯（low molecular weight fucoidan, LMWF) : LF1 (相对 分子质量3 700,硫酸根含量30. 7%) ; LF2 (相对分 子质量7 300,硫酸根含量32.5%);相对中相对分 子质量岩藻聚糖硫酸酯（middle molecular weight fu¬coidans, MMWF) ：MFa (相对分子质量19 000,硫酸 根含量28.5%) ; MFb (相对分子质量28 000,硫酸 根含量34.6%)。分别用生理盐水配成0.6 ^mol • L-1溶液备用。血管性血友病因子测定药盒（上海 船夫生物科技有限公司）；水合氯醛、磷酸盐缓冲液 (PBS)及其他试剂均为国产分析纯。大鼠抗人单克 隆抗体 CD31—PE、CD514TTC (美国 Invitrogen 公 司）;高糖DMEM培养基（美国Gibco公司）；小牛血 清（杭州四季青生物工程材料公司）;胰蛋白酶（美 国DFICO公司）；肿瘤坏死因子（TNF—a)(华美生 物工程有限公司）；鞘液（美国BECKMAN COUL¬TER 公司，ISOTON 1);标准荧光微球（美国BECK- MAN COULTER 公司 , FLOW-CHECK) 。

　　1.4主要仪器全自动石蜡切片机（德国SLEE公司，6022 型）;光学显微镜（OLMRAS公司，日本）；高速冷冻 离心机（上海安亭科学仪器厂,TGL -16G-A);全 自动酶标仪（BECKMAN COULTER公司,AD340,美 国）；CO2孵育箱（美国Themro Fomra公司， Model311);流式细胞仪（美国 BECKMAN COULTER 公司，Epics XL • MCL)。

　　2方法

    2.1分组与给药大鼠随机分为正常对照组、模型组和4个岩藻 聚糖磷酸酯组（分别为LF1组、LF2组、MFa组和 MFb组），每组10只，全部为雄性。正常对照组和 模型组腹腔注射给予1 mL • 100 g-1生理盐水,其他 各组分别腹腔注射给予岩藻聚糖硫酸酯0. 01 ^mol •kg-1,每日1次,持续5 d。

　　2.2大鼠内皮损伤模型制作&3各岩藻聚糖硫酸酯实验组和模型组分别在每日 早、中、晚于背部相同部位皮下注射肾上腺素（0.4 mg • kg — 1),正常对照组皮下注射等量生理盐水，持 续5d。每日早晨给药1h后麻醉,腹主动脉取血约2 mL,置枸橼酸钠抗凝管（抗凝剂与血样体积比为 1:9)中备用。

　　2.3病理学切片制作大鼠取血后,快速分离胸主动脉,先用磷酸盐缓 冲液冲洗干净管腔内的血液，再用4%多聚甲醛固 定24 h。横截切取主动脉弓下血管段约0.5 cm,经 包埋后切片，切片厚度5 pm。经HE染色后,进行脱 水透明、封固，备用。

　　2.4内皮损伤情况切片观察和血管性血友病因子 (vWF)的测定内皮损伤情况切片观察：将病理学切片置光学 显微镜下观察内皮损伤情况。大鼠血浆vWF的测 定:将抽取的各时段抗凝血,3 000 r • min-1,离心10 min。采用酶联免疫法（ELISA)按照试剂盒操作说 明，测定血浆VWF水平。

　　2.5人脐静脉内皮细胞的培养a14a细胞复苏后,加入高糖DMEM培养液约5 mL, 培养瓶中接种,每3 ~4 d换液1次。待内皮细胞生 长铺满瓶底后即可传代。吸去培养基，用无血清 RPMI 1640 2 mL洗培养瓶1次。加入0. 1%胰酶、0. 02%EDTA-Na- 3 mL,放 CO2孵育箱（5% CO2, 37 °C)中培养,隔天换液,约4 d进行1次消化传代。取 对数生长期细胞,经消化、离心后,弃去上清液,加入 冻存液,调节细胞约为1 x 107个• L―1,冷冻,备用。

　　2.6 vWF和EMPs指标检测

   2.6.1vWF水平检测0 将上述培养的内皮细胞• 2113 •Chin Pharm J, 2015 December, Vol. 50 No. 24按5 x105接种于24孔细胞培养板,并随机分为下列 各组,每组样本数为8。接种24 h后弃全部上清液， 按以下实验分组要求加入实验培养液:①正常对照 组:加入完全培养液;②模型组:培养液中加入肾上 腺素,使最终质量浓度为10 mg • L-1;③LF1组:培养 液中加入LF1和肾上腺素,使最终浓度分别为0. 01 ^mol • L-1和10 mg • L-1;④LF2组:培养液中加入 LF2和肾上腺素,使最终浓度分别为0. 01 ^mol • L-1 和10 mg • L-1;⑤MFa组:培养液中加入MFa和肾上 腺素,使最终浓度分别为0.01 ^mol • L-1和10 g • L-1;⑥MFb组:培养液中加入MFb和肾上腺素,使最 终浓度分别为0. 01 ^mol • L-1和10 g • L-1。分别在加药后的24和48 h取100 ^L上清液， 采用酶联免疫吸附试验（ELISA),按照试剂盒说明 测定vWF水平。

　　2.6.2EMPs检测将体外培养生长良好的内皮细 胞按5 x105个接种于24孔细胞培养板,并随机分为 下列各组,每组样本数为3。接种24 h后弃去上清 液,按以下实验分组要求加入实验培养液:①正常对 照组：加入完全培养液；②模型组：培养液中加入 TNF-a( 100 ng • mL-1)；③LF1组：培养液中加入 LF1和TNF—a,使最终浓度分别为0. 01 ^mol • L-1 和100 ng • mL-1;④LF2组：培养液中加入LF2和 TNF—a,使最终浓度分别为0.01 ^mol • L-1和100 ng • mL-1;⑤MFa组：培养液中加入MFa和TNF- a,使最终浓度分别为0.01門l • L-1和100 ng • mL-1;⑥MFb组：培养液中加入MFa和TNF—a,使 最终浓度分别为0. 01 ^mol • L-1和100 ng • mL-1。药品加入完成后，于37 C剌激人脐静脉内皮细 胞24 h ,按文献1344]方法采用流式细胞仪进行 检测和分析。

　　2.7数据统计分析与处理各组数据以x ± s表示，用SPSS11. 5统计分析 软件,以单因素方差分析和q检验进行统计比较。

　　3 结果

    3.1 光学显微镜下病理检查结果造模5 d后，各组胸主动脉HE染色后切片的 光学显微镜下结果见图1。正常对照组胸主动脉有 较完整的内皮层，表面光滑;模型组可见内皮层有严 重的脱落或断裂；而LF1组合LF2组有内皮层断 裂,未见脱落现象；MFa组合MFb组有内皮层有少 许断裂,分离现象，内皮损伤较LF1和LF2组较重， 但较模型组为轻。说明反复注射较大剂量的肾上腺• 2114 •Chin Pharm J, 2015 December, Vol. 50 No. 24素可造成血管内皮的损伤，而LMWF能够对抗这种 由肾上腺素造成的血管内皮损伤，具有内皮细胞保 护作用，且其内皮的保护作用明显强于MMWF。

　　3.2 大鼠血浆vWF浓度大鼠注射肾上腺素的5 d时间里，正常对照组 的vWF水平基本没有变化。模型组的血浆vWF浓 度先降低,然后逐渐升高,在第5天与正常对照组比 较，出现明显差异（P <0. 05) ; LMWF组的vWF水 平逐日降低，与当日正常对照组相比,均无统计学差 异,第5天与当日模型组相比，血浆vWF浓度出现 明显差异（P <0. 05)。各MMWF组的vWF水平呈 逐渐升高状态，但与当日正常对照组和模型组相 比，均无统计学差异。结果提示，LMWF均能够降 低血管内皮损伤大鼠血浆中vWF的水平。结果见 表1。

　　模型组中vWF水平从第1天的较高水平到第2 天先有一个降低,然后从第3天起又开始逐渐升高。 可能是由于在首次大剂量注射肾上腺素剌激导致的 应激反应,而这一升高在机体自身调节的情况下,逐 渐恢复。但是，伴随着血管内皮损伤的加重，vWF 水平再次逐渐升高，则表明此时内皮细胞损伤已经 逐渐发展成为了一个不可逆的病理过程。

　　3. 3体外岩藻聚糖硫酸酯对肾上腺素剌激内皮细 胞释放vWF的影响正常对照组培养上清液中培养24和48 h的 vWF含量随时间推移，逐渐升高；模型组与同时段 正常对照组相比,vWF水平均显著升高（P <0.01); 与同时段模型组比较,LMWF组均能够使24和48 h 培养液的vWF含量明显降低（P <0. 01),而MMWF 组vWF水平与模型组无统计学差异。见表2。

　　3. 4体外岩藻聚糖硫酸酯对TNF—a剌激释放内皮 细胞微颗粒的影响人脐静脉内皮细胞生成的微颗粒CD31及 CD51表达阳性。模型组受TNF—a剌激后，组内皮 细胞微颗粒水平显著高于正常对照组（P <0.01); LMWF组的内皮微颗粒数目显著低于模型组 (P <0. 01),而与正常对照组无统计学差异；MMWF 组的内皮微颗粒数目比正常对照组明显增多 (P <0. 01),数目虽比模型组有所减少,但无统计学 差异（P >0.05)。提示低相对分子质量的岩藻聚糖 硫酸酯可减少TNF—a剌激引起的内皮微颗粒脱落。 数据见表3。

　　4讨论

   当血管壁受到某些因素的剌激后，尤其是血管 壁结构完整性遭到破坏时,就会暴露出胶原和组织 因子，胶原可激活血小板体系使其凝聚，组织因子 可激活凝血体系经过一系列级联反应使纤维蛋白原转化成纤维蛋白，导致血栓形成。由此可见,对血管 内皮的保护是防止血栓形成的一个重要途径。

　　本实验同时采用体内研究和体外研究的方法, 探讨了不同相对分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯对内 皮细胞的保护作用。在体内研究中，我们通过制作 苏木精-伊红（hematoxylin—sosin, HE)染色切片，在 光学显微镜下观察了大鼠胸主动脉内皮层的变化, 可直观的看出，LMWF对大鼠血管内皮细胞具有明 显保护作用，且其保护作用强于MMWF。

　　另外,在体内实验中，采用vWF作为内皮损伤 指标,定量考察了不同相对分子质量岩藻聚糖硫酸 酯对内皮细胞的保护作用。vWF又称因子V1相关 抗原，主要由内皮细胞分泌，可参与血小板的黏附反 应。vWF所介导的血小板与损伤血管壁黏附的过 程是影响血栓形成重要而关键的一步。当血管受损 时,vWF就会沉积在血管损伤部位，并与特定的血 小板膜受体结合,从而介导血小板黏附于血管内膜 下层，并启动血栓形成。换言之，vWF是血小板黏 附到损伤血管内皮之间的桥梁&548。本实验的体 内研究结果证明，LMWF具有降低vWF水平的功 能,而MMWF虽然可一定程度上降低vWF水平，但 与模型组比较,差异无统计学意义。

　　在本实验中，通过体外培养人脐静脉内皮细胞应用肾上腺素造成损伤，测定vWF水平，所得结论 与体内研究结果相同。说明无论是在体内还是体 外,LMWF均可降低由于肾上腺素损伤所造成的 [8 ] vWF分泌增高，比较而言，MMWF抑制内皮细胞分 泌vWF的作用要弱得多。

　　本实验采用内皮细胞黏附分子（CD31)和玻连 [9] 蛋白（CD51)双阳性鉴定法M ,利用流式细胞仪,检 测了细胞培养液中岩藻聚糖硫酸酯对内皮细胞释放 EMPs的抑制作用。实验发现,LMWF可显著抑制由 [10] TNF-a剌激产生的EMPs,而MMWF对EMPs的产 生没有抑制作用 。 11本实验结果表明，LMWF对内皮细胞具有良好 的保护作用；而MMWF虽然对内皮细胞的损伤有所[12]改善,但这种保护作用远低于LMWF。同时可以推 断出，LMWF可通过降低EMPs浓度和vWF浓度，阻断血小板与受损血管部位的胶原结合,从而抑制 13 血小板活化,发挥保护内皮的作用。