三种中药对解脲支原体的体外抑制实验特性

　解脲支原体（urea plasma urealyticum，Uu）是介于细菌和病毒之间、目前所知的能独立生活的最小微生物。它主要通过性接触传播，可导致非淋菌性尿道炎、子宫内膜炎等疾病，严重者可致女性不孕不育症、自然流产，且高浓度Uu感染的女性患不孕症的危险比正常人群相对高出近3倍[1]。临床上常用大环内酯类及喹诺酮类抗菌药治疗Uu感染，但由于广谱抗生素的广泛应用以及不正确使用等原因，Uu的耐药现象越来越常见。近年来以单味中药或复方中药制剂治疗泌尿生殖道Uu获得较为满意的疗效，且具有副作用少的优点[2-3]。据资料记载，莪术含有姜黄素、莪术醇、异莪术醇等20多种成分，在抗病毒、抗菌和抗肿瘤方面具有较好的作用[4-5]；鱼腥草化学成分复杂，主要成分有挥发油、生物碱、黄酮、多糖和有机酸等，具有较好的抗炎活性[6-8]；土茯苓含多种化学成分，有糖类、有机酸黄酮苷类、皂苷类及挥发油成分，具解毒利湿、抗菌消炎功效[9-11]。本实验以本院就诊女性患者生殖道Uu临床菌株作为标本，旨在研究莪术、鱼腥草及土茯苓对Uu的体外抑菌作用，对本院研发治疗Uu感染的新型复方洗液作实验依据。
　　
　　1 材料与方法
　　1.1 试剂及中药的制备
　　本实验采用珠海迪尔生物工程有限公司生产的DL Medical液基型支原体培养基，实验所用的莪术、鱼腥草、土茯苓生药均来自本院中药房。秤取100g生药，置烧杯中略粉碎后，加入200~300mL蒸馏水浸泡30min，用电炉煎热15～30min，过滤，留取滤液。向生药沉渣再加入适量蒸馏水以相同方法煎制，过滤，沉渣弃去，混合2份滤液。冷却至室温后以3000r/min离心15min，留取上层清液，蒸发或补充蒸馏水，将最终浓度调整为1g/mL。以50%枸橼酸钠调整pH值在5.5～6.0间。分装，置高压锅中121℃，15min灭菌。4℃保存备用。
　　1.2 病例选择及标本留取
　　选取2013年11月1日～2014年2月1日期间已确诊为生殖道Uu感染，并尚未用抗菌药治疗的女性患者共98例。标本由本院妇科医生用无菌棉拭子去除阴道多余分泌物，再用无菌棉拭子伸入宫颈口1～2cm旋转并停留30s取出标本，立即接种于支原体液体培养基中，送检。
　　1.3 培养及药敏试验、
　　1.3.1 Uu培养 参考Robertson JA研究中的方法[12]，Uu经过三次传代培养，菌液调整为8×104CCU/mL作为工作菌液。
　　1.3.2 中药MIC的确定 先将液体培养基、工作菌液、中药制剂96孔细胞培养板置于37℃恒温箱中预热2h。参考Kenny等[13]的研究方法，稍加修改，连续倍比稀释中药。（1）在96孔（8×12）无菌细胞培养板中第1孔加入液体培养基75μL，第12孔加入100μL，第3～11孔加25μL；（2）第2、3孔各加25μL中药制剂；（3）从第3孔开始，用微量移液器反复吹打混匀，吸出25μL至下一孔，用微量移液器反复吹打混匀，依次类推，直至第1l孔，混匀后吸出25μL弃去；（4）第2～11孔加培养基50μL；（5）第1～11孔加入工作菌液25μL，即第1孔为菌液对照，第12孔为阴性对照，至此，所有孔内液体最终体积为100μL。从3～11孔的中药浓度依次为250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.90、1.95、0.97、0.48mg/mL，共10个稀释度。（6）加样完毕后，每孔滴加2滴无菌石蜡油，合盖置37℃恒温孵育箱培养24h，观察结果。当菌液对照由黄色变为红色即阳性，阴性对照为阴性时，判读结果，以不出现颜色变化的最小药物浓度为该种中药对该例Uu的最小抑制浓度（MIC）。
　　2 结果
　　经分析，结果表明鱼腥草MIC范围为3.90～62.5mg/mL，莪术MIC范围为3.90～62.5mg/mL，土茯苓MIC范围为7.81～62.5mg/mL。结合MIC50及MIC90分析，本实验所选的Uu临床菌株对鱼腥草有较好的敏感性，莪术次之，土茯苓居第3位。具体结果见表1。
　　
　　表1  中药对UU临床菌株体外抑制试验MIC（mg/mL）
　　中药 范围 MIC50 MIC90
　　鱼腥草 3.90～62.5 15.63 62.5
　　莪术 3.90～62.5 31.25 62.5
　　土茯苓 7.81～62.5 31.25 62.5
　　
　　3 讨论
　　目前治疗泌尿生殖道Uu感染仍主要依靠喹诺酮类或大环内酯类抗菌药如环丙沙星、红霉素治疗，但随着广谱抗菌药的[第一论文 网(www. ) 专业提供论文写作和写作论文的服务,欢迎光临]普及，以及使用不当等原因，耐药的Uu菌株愈来愈常见，Uu对喹诺酮类抗菌药的耐药现象可高达60%[14]。以中药治疗泌尿生殖道Uu感染，具有毒副作用较少的优点，临床试验及治疗也获得了较满意效果。
　　中药对支原体的MIC目前国内尚无统一标准，参照同类实验[15]，MIC≤7.81g/L为敏感，MIC介于7.81～250g/L为中度敏感，MIC＞250g/L为不敏感。本实验结果显示Uu临床菌株对三种中药在体外均有较好的敏感性，以鱼腥草效果最显著。三种中药均具有清热解毒、健脾护肝、抗炎抗菌作用[8-9]。莪术在体内具有的抗肿瘤、抗炎的作用，且其在体内的抗Uu作用也被证实为有效[3]，本实验莪术的抗Uu体外抑制试验结果，从另一侧面为莪术的抗Uu疗效提供又一佐证。鱼腥草和土茯苓能增强白细胞的吞噬作用，从而增强机体免疫功能，已用于治疗呼吸道病毒与细菌感染的疾病[16]。其缓解炎症引起的水肿、疼痛效果也颇为显著[17]。本实验结果显示鱼腥草及土茯苓在体外试验中均具有较好的抗Uu作用，值得进一步研究。
　　中药的化学成分复杂，关于其中内含的化合物及其成分作用的研究仍然较少。中药治疗虽具有毒副作用小的优点，但鱼腥草注射液引起个体过敏反应的报道并不少见，可见中药成分的药理作用及抑制Uu的机制仍有待考究，其体内外作用结果也有所差别。本实验旨在初步探讨莪术、鱼腥草及土茯苓对Uu临床菌株的体外抑制作用，但尚未研究对Uu的14种不同血清型标准菌株进行体外抑制试验，以及对Uu临床菌株进行血清型分组。另外，本实验的样本量还存在偏少的不足。尽管如此，本次实验初步证明了三种中药体外抗Uu的有效性，为进一步研究中药抗Uu作用提供参考及方向。
　　
　　[参考文献]
　　
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　　[12] Robertson JA，Stemke ed serotyping scheme for Ureaplasma urealyticum strains isolated from humans[J].J Clin Microbiol，1982，15（5）：873-878.