X射线照射后Rac1蛋白对慢性粒细胞白血病K562细胞

Racl全称为Ras相关的C3肉毒素底物1，基因全长29Kb，定位于人染色体7p22，其转录产物有1.2kb和2.5kb两种，均在组织特异性高的组织中表达[1，2]，Rac1蛋白主要通过影响细胞形态，细胞的迁移，细胞周期进，基因转录调节，细胞的增殖、凋亡，血管形成等多方面来对肿瘤起作用。本次实验主要研究Rac1蛋白对辐射诱导K562细胞凋亡的影响机制。
　　1资料与方法
　　1.1一般资料 K562细胞株购自上海中科院细胞研究所，RPMI-1640培养基为四季青公司产品，新生牛血清为Gibco产品，藻红B染色购于上海四季青公司，兔抗Rac1（c-14）多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗、兔源性抗人Actin抗体均购自美国Santa Cruz公司，直线加速器购于西门子公司（剂量率200cGy/min）。
　　1.2细胞凋亡分析 K562细胞用含有10%新生牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养至对数生长期，X射线分0、2、4、8 Gy四个剂量点照射对数生长期K562细胞，于照后24h和72h收集细胞，用染料藻红B﹙Erythrosine B﹚对细胞染色，活细胞不能被染色，死细胞的核被染成红色，根据被染色细胞占总观察细胞的百分率计算细胞的凋亡率，每次处理观察200个细胞。
　　1.[第一论文网lunwen. 1KEJIAN.C OM专业提供写作论文和毕业论文写作服务，欢迎您的光临]3 Western blot 0、2、4、8 Gy的X射线照射对数生长期K562细胞，于24 h、72h收集细胞，用含苯甲基磺酰氟的裂解液提取细胞总蛋白，未经照射的细胞作为对照组，BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白上样，12%SDS-PAGE凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜上。5% 脱脂奶粉室温封闭3h。洗膜后加入兔抗Rac1（c-14）多克隆抗体（1：1000稀释）封闭2h，TBST洗膜3次，10min/次，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1：2000稀释）37℃ 杂交1h，曝光、显影、定影。
　　1.4统计学处理 数据用SPSS11.5统计软件进行分析。剂量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用均数t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1不同剂量X射线照射K562细胞的凋亡率 用0、2、4、8 Gy的X射线照射K562细胞，分别在24h、72h时收集细胞，藻红B染色的方法检测细胞的凋亡率，由表1可以看出，随着剂量的增加，两个时间点的凋亡率亦增加，呈现一定的剂量相关性。由表1亦可看出受照后72h的细胞凋亡率明显高于24h的细胞凋亡率。
　　2.2 X射线照射后K562细胞中Rac1蛋白表达变化 0、2、4、8Gy的X射线照射K562细胞后，由图1可见总的Rac1蛋白表达未发生明显变化，72h时Rac1蛋白表达水平比24h时Rac1蛋白表达水平有所减少。
　　3讨论
　　细胞凋亡（apoptosis）是正常机体细胞在受到刺激后出现的一种自发的程序性死亡过程，它是一个能被抑制或激活的可调节过程，调节失衡则是肿瘤产生的一个重要机制。电离辐射可通过直接或间接作用抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡。本实验所选的K562细胞在8GyX射照射后72h时细胞的凋亡率仅约13%，表现出一定程度的电离辐射抗性，但随着照射剂量的增加和时间的延长，K562细胞凋亡率有逐渐升高趋势，呈现时间、剂量依赖性。而Racl作为Rho蛋白家族中的重要一员，是Ras基因的下游分子，参与了ras基因的恶性转型，而其本身也是个癌基因，它的激活也可以导致细胞的癌变[3]。有研究发现它在宫颈癌、结肠癌 、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达，其主要通过促进肿瘤细胞的增值、侵袭和转移在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[4-8]。有研究发现活化的Rac1可促进整合素类蛋白分子在细胞头部表面募集，进而诱导肌动蛋白微丝聚集于细胞质膜，导致细胞膜多极化，从而影响细胞的运动迁移，它还可以激活Ⅳ型胶原酶，促进细胞外基质降解，增强肿瘤细胞侵袭穿透能力。Rac1也可通过调节NF-kB活性及增加[第一论文网lunwen. 1KEJIAN.C OM专业提供写作论文和毕业论文写作服务，欢迎您的光临]细胞内超氧化物阴离子的浓度进而抑制肿瘤细胞凋亡。Rac1有可能作为反映肿瘤生物学行为的一种新型标志物。本研究采用不同剂量的X线照射慢性粒细胞白血病K562细胞，WB方法检测不同时间点Rac1蛋白的表达，发现照射前后总的Rac1蛋白表达量无明显变化，但随着时间的延长，Rac1蛋白的表达量有所减少。由此可推断Rac1参与了辐射诱导K562细胞凋亡的过程。Rac1蛋白表达的减少可促进K562细胞的凋亡率的增加，抑制Racl蛋白表达可以促进K562细胞的凋亡。这将为临床肿瘤放射治疗提供新的治疗靶点。
　　参考文献：
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