姜黄素纳米微粒对体外胃癌MGC803细胞凋亡机制的

胃癌是临床上常见的一种恶性肿瘤，严重危害人类的健康。抗肿瘤药物的研究特别是从天然植物中筛选抗肿瘤新药的有效成分，是目前常用的筛选抗肿瘤药物的方法。姜黄素是从姜科植物中提取的一种酚类物质，分子量相对较小，在大多数姜黄制剂中均有此类物质存在。姜黄素的药理作用非常广泛，具有抗氧化、抗肿瘤、清除自由基、抗微生物等多方面作用。姜黄素在水中的溶解度较低，体内吸收较少，可以采用乳化聚合的方法，制备粒径在250 nm左右的表面带正电荷的聚氰基丙烯酸正丁酯包载的姜黄素纳米微粒用作实验研究[1-2]。笔者实验将姜黄素纳米微粒体外作用于人胃癌细胞株MGC803，观察姜黄素纳米微粒对人胃癌细胞株MGC803体外生长抑制、细胞周期改变、凋亡相关Bcl-2蛋白表达的作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 试剂和仪器
　　人胃癌MGC803细胞株由中国医学科学院细胞库提供；姜黄素、RPMI-1640培养基、胎牛血清、MTT试剂盒、顺铂、碘化丙啶、RNase A、Bcl-2蛋白单抗及SP试剂盒购于武汉博士德生物公司；姜黄素纳米微粒委托哈尔滨医科大学基础医学院遗传学教研室黄小义博士制备；自动切片机LEICA RM2165德国生产；电子显微镜JEM-1220型由荷兰Philip公司生产；Dydatech MR4000型酶标仪购自Santa Cruz公司；其他均为国产分析醇试剂。
　　1.2 细胞培养及分组
　　人胃癌MGC803细胞株购买后常规无菌条件下培养，细胞株稳定后传代，并且冻存细胞为实验所用。实验中无菌条件下培养人胃癌MGC803细胞株，培养液为经过0.22 μm滤膜过滤的RPMI-1640，培养条件为37℃ 5% CO2饱和湿度温箱，用PBS配制的0.15%胰蛋白酶消化细胞传代，收集处于指数生长期的人胃癌MGC803细胞。将人胃癌MGC803细胞分为三组：姜黄素纳米微粒组、姜黄素组、实验对照组，给予对应药物处理，实验对照组不加药。
　　1.3 方法
　　1.3.1 MTT法检测人胃癌MGC803细胞的生长抑制情况 将处于指数生长期的MGC803细胞制成1 ×107个/mL细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔200 μL，给予不同浓度药物处理，37 ℃ 5% CO2培养箱继续培养24 h后，弃液，加入无血清培养液180 μL，再每孔加入20 μL MTT，于培养箱放置4 h ，弃上清，每孔加DMSO，充分振荡，酶标仪于570 nm检测各孔吸收值。以空白对照组细胞调零，横坐标为时间，纵坐标为细胞抑制率，测定不同浓度姜黄素纳米微粒、姜黄素对人胃癌MGC803细胞在不同时间的生长抑制率，绘制细胞生长抑制曲线。
　　1.3.2 肿瘤细胞形态学光镜观察 将5×104/mL人胃癌MGC803细胞悬液接种于内铺小玻璃片的24孔培养板内，置于37℃ 5% CO2孵箱内培养后用PBS洗涤两次，瑞氏液染色10 min，再用PBS洗两次，室温干燥，中性树胶封片，光学显微镜下观察人胃癌MGC803细胞形态。
　　1.3.3 肿瘤细胞形态学透射电镜观察 收集胰蛋白酶消化的人胃癌MGC803细胞107个/mL，2.5%戊二醛预固定2 h，四氧化锇固定，梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，连续切片，醋酸铀及枸橼酸铅双染色，最后透射电镜（JEM-EX）观察拍照。
　　1.3.4 流式细胞仪检测细胞周期分布 姜黄素纳米微粒20 μg/mL、姜黄素20 μg/mL分别作用于人胃癌MGC803细胞，培养收集106个/mL细胞，PBS洗涤，乙醇固定，RNase A处理细胞30 min，加PI处理，检测人胃癌MGC803细胞的细胞周期分布，统计实验结果。
　　1.3.5 免疫组化检测Bcl-2 蛋白的表达 实验各组常规制备人胃癌MGC803细胞，4℃丙酮固定，用单克隆-免疫组化S-P法标记Bcl-2蛋白，PBS代替一抗做阴性对照，DAB显色，PBS洗涤，苏木素染色，脱水，透明，封固，镜下观察拍照，并进行图片分析。
　　1.4 统计学方法
　　采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，三组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 各组MGC803细胞生长抑制情况
　　不同浓度姜黄素纳米微粒及姜黄素对人胃癌MGC803细胞的生长均有明显的抑制作用，随着药物浓度的增加，抑制作用更加明显，但姜黄素纳米微粒组20 μg/mL与28μg/mL药物浓度对人胃癌MGC803细胞株生长抑制作用差异无统计学意义（P > 0.05），提示20 μg/mL是姜黄素纳米微粒抑制人胃癌MGC803细胞株的最佳浓度。见图1、2。
　　2.2 光镜下观察各组处理后人胃癌MGC803细胞情况
　　正常培养的实验对照组光学显微镜下观察细胞生长旺盛，细胞单层排列，形态规则，贴壁效果较好，细胞形态为长梭形或者多边形，边界较规则，细胞核清晰，可以观察到核仁，细胞质中细胞器丰富，提示细胞代谢旺盛，生长较好（图3）；20 μg/mL姜黄素纳米微粒作用于人胃癌MGC803细胞，光学显微镜下观察到细胞形态不规则，边界不清楚，细胞质染色较浅，提示细胞受到一定程度的损伤，细胞代谢功能低下（图4）；20 μg/mL姜黄素作用于人胃癌MGC803细胞后，细胞边界不清，细胞形态不规则，可以见到细胞包涵体的存在（图5）。
　2.3 电镜观察各组处理后人胃癌MGC803细胞情况
　　电子显微镜下观察到正常培养的实验对照组人胃癌MGC803细胞边界清晰，细胞核圆形，较大，核仁明显，细胞质中细胞器丰富，线粒体丰富，粗面内质网丰富，细胞中异物较少（图6）；20 μg/mL姜黄素纳米微粒作用于人胃癌MGC803细胞后，观察到细胞质中出现异物颗粒，细胞器较少，线粒体数目较少，滑面内质网较少，提示细胞合成蛋白质及其他物质的能力下降，细胞功能低下（图7）；20 μg/mL姜黄素作用于人胃癌MGC803细胞后，细胞器不丰富，线粒体数目较少，细胞质中有很多异物颗粒出现（图8）。
　　2.4 各组不同处理对人胃癌MGC803细胞周期的影响
　　姜黄素纳米微粒组和姜黄素组作用于MGC803细胞后细胞周期发生改变，姜黄素纳米微粒组人胃癌MGC803细胞周期G2/M期比例明显降低，与实验对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05），提示姜黄素纳米微粒作用于人胃癌MGC803细胞主要是通过影响细胞G2/M期，诱导肿瘤细胞的凋亡。见表1。
　　2.5 各组不同处理对人胃癌MGC803细胞Bcl-2蛋白表达的影响
　　正常培养的实验对照组人胃癌MGC803细胞Bcl-2 蛋白产物染色呈阳性，细胞质中棕黄色颗粒较多，细胞生长状态良好，细胞单层排列，细胞形态规则，细胞核仁清晰（图9） ；20 μg/mL姜黄素纳米微粒作用于人胃癌MGC803细胞，Bcl-2蛋白产物染色呈阴性或者弱阳性，蛋白表达量减少，细胞容易发生凋亡（图10）；20 μg/mL姜黄素作用于人胃癌MGC803细胞Bcl-2 蛋白产物染色呈阴性，棕黄色颗粒较多，细胞大部分边界不清楚（图11）。
　　3 讨论
　　胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一， 随着慢性胃炎、胃溃疡发病率的提高，胃癌的发病率也不断上升，且确诊时常常已到晚期，预后差，严重威胁着人类健康。目前胃癌的病因及发病机制十分复杂，对胃癌治疗放、化疗方案又都伴有明显的不良反应，患者往往因无法忍受而中途放弃治疗。中医药提取物姜黄素以其低毒性、低不良反应性成为肿瘤治疗的常用药物[3-4]。姜黄素对多种肿瘤细胞具有抑制生长及诱导凋亡作用，但就不同类别肿瘤而言，其抗肿瘤机制各不相同，有些作用机制甚至是相互矛盾的。姜黄素具有毒副反应轻、来源广、易获取、价格低等优点，使其具有广阔的临床应用前景，临床上目前正大量使用此类药物进行肿瘤治疗。
　　本实验观察了姜黄素纳米微粒对胃癌细胞MGC803体外生长的抑制作用，结果显示，姜黄素纳米微粒与姜黄素均对人胃癌MGC803细胞的生长有明显的抑制作用，随着药物浓度的增加，抑制的作用更加明显，与姜黄素相比，姜黄素纳米微粒起效慢，但二者作用强度相仿，无显著差异。这是因为姜黄素纳米微粒的制剂中有纳米微粒包裹，处在表面的姜黄素首先释放，而位于内部的姜黄素较慢释放，这样就形成了药物产生作用慢，但时间较长的特点。研究结果提示20 μg/mL是姜黄素纳米微粒抑制人胃癌MGC803细胞株的最佳浓度。
　　光学显微镜下观察到20 μg/mL姜黄素纳米微粒作用于人胃癌MGC803细胞，细胞形态不规则，边界不清楚，细胞质染色较浅，提示细胞受到一定程度的损伤，细胞代谢功能低下；20 μg/mL姜黄素作用于人胃癌MGC803细胞后，细胞边界不清，形态不规则，可以见到细胞包涵体的存在。电镜观察发现，20 μg/mL姜黄素纳米微粒作用于人胃癌MGC803细胞，细胞质中出现异物颗粒，细胞器较少，线粒体数目较少，滑面内质网较少，提示细胞合成蛋白质及其他物质的能力下降，细胞功能低下；20 μg/mL姜黄素作用于人胃癌MGC803细胞后，细胞器不丰富，线粒体数目较少，细胞质中有很多异物颗粒出现。这些形态学指标均提示20 μg/mL是姜黄素纳米微粒处理人胃癌MGC803细胞株的较为适宜的浓度。
　　细胞凋亡是细胞的程序化死亡，涉及的蛋白质有多种，其中Bcl-2是抑制细胞凋亡的重要蛋白质，也是决定肿瘤预后的重要指标，最初从B细胞淋巴瘤中鉴定出来，对于多细胞生物体的发育至关重要。Bcl-2蛋白质又称为长寿蛋白，可保护细胞免于凋亡，使细胞寿命延长[5-6]。本研究发现，姜黄素纳米微粒组和姜黄素组作用于MGC803细胞后细胞周期发生改变，G2/M期比例明显降低，与实验对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），提示姜黄素纳米微粒作用于人胃癌MGC803细胞主要通过影响细胞G2/M期，诱导肿瘤细胞凋亡。由上文结果可见，20 μg/mL姜黄素纳米微粒作用于人胃癌MGC803细胞，Bcl-2蛋白产物染色呈阴性或者弱阳性，蛋白表达量减少，细胞容易发生凋亡；20 μg/mL姜黄素作用于人胃癌MGC803细胞Bcl-2 蛋白产物染色呈阴性，棕黄色颗粒较多，细胞大部分边界不清楚。本实验证实，姜黄素纳米微粒的作用与姜黄素相似，均能通过下调MGC803细胞中Bcl-2 蛋白的表达诱导凋亡。
　　总之，20 μg/mL姜黄素纳米微粒可抑制胃癌MGC803细胞的生长，且具有缓慢控制释放的效应，说明姜黄素纳米微粒可望成为肿瘤化疗的较好的新制剂，为临床抗肿瘤的研究提供理论依据。
　　[参考文献]
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