在研究细胞自噬与肿瘤发生的关系实验中应该用什么为研究对象 毕业论ddyf
有，单细胞是有细胞自噬功能的，自噬在单细胞生物中特别重要。单细胞生物不能在一个细胞中储存太多营养物质。它们需要依赖溶酶体的细胞内降解过程。
在生活、工作和学习中，大家都尝试过写作文吧，通过作文可以把我们那些零零散散的思想，聚集在一块。你写作文时总是无从下笔？以下是我为大家收集的高三作文8篇，仅供参考，欢迎大家阅读。
“离群索居者不是野兽，就是神灵。”这充满哲思的话语是亚里士多德的哲学遗产。
人是群居的动物，大部分人喜欢聚在一起，享受热闹和繁华，但这也往往使他们丧失自我，因而大部分人都介于野兽和神灵之间。哲人们往往选择独居，体验“无丝竹之乱耳，无案牍之劳形”的自在，追求接近神灵的精神。
哲人们的思想固然带来一定的影响和思考，并产生了“众人皆醉我独醒”的清高。在我看来，“隐于野”不过是“身独”，“隐于市”却是 “心独”，而“心独”比“身独”更为重要。
“隐于市”的“心独”是安静而强大的。这是一种像休眠火山一样寂静着却巨大无比的力量。中国核潜艇之父黄旭华三十年如一日，抛弃对世俗的繁华甚至与家人失去联系，凭借着坚韧而独立的内心为中国国防科技事业添上浓墨重彩的一笔。他的三十年是隐忍的三十年，是赫赫而无名的三十年，更是将“心独”铭刻在中国人心中的三十年。
“隐于市”的“心独”是理性而又热情的。“我的兴趣在于做别人不做的事情”20xx年诺贝尔生物学奖得主大隅良典一直坚持这样的习惯。放弃热门的化学专业，选择无人问津的生物领域，研究细胞自噬问题，从不跟风，最终解决困扰人们长达60年的难题，独摘科学硕果。他的“心独”让他自己不受世俗干扰实现梦想，更推动全世界的科学进步。
“隐于市”的“心独”是高贵而朴素的。含着金钥匙出生的列夫托尔斯泰在文坛上的成就无人能及。他不受权贵等级旧思想的桎梏，葆有悲天悯人的内心。他的“心独”是他“如夏花之绚烂”高贵的生命，是他“如秋叶之静美”林荫下朴素的坟墓；他的“心独”是他位列世界文坛巨匠却不夸耀的态度和品格。
在如今的社会中，喧嚣充斥着人们的内心，人们往往选择逃避现实，本以为可以体会“悠然见南山”的闲适，熟不知逃避只能带来短暂的满足，久而久之便会变得麻木迷茫。
黄旭华，大隅良典，列夫托尔斯泰在不同的领域取得卓越的成就，共同之处便是不逃避现实，在工作中葆有自已的内心，持续追求。
“离群索居者不是野兽，就是神灵。”精辟！亚里士多德的话语。
对江南憧憬已经很久了。
向往的当然有酥酥软软的江南侬语，烟波中的清丽女子，弹词，织锦，水，还有多情的故事和传说。很多人都向往这些，我岂能免俗。
不过，我心中还有一个江南。或许有人用文字触碰过，但我还是要说，淋漓尽致的讲我的江南。想，我的江南决不类似于别人的。人有不同，江南也有不同，正如一千读者眼中的一千林黛玉。
好多份江南的色彩介于朦胧与清透间，仿佛江南生来就是水做的软柔的一般。这大概也算是通识吧。
我的江南，我大胆的说：“是刚硬的，是火热的，是沸腾的！”
到过“远山来与此堂平”的史公祠，到过崖山，到过南京，到过南昌，到过武昌。每一处都曾有过血与火的颂歌，忠贞坚毅，誓死报国，热血不屈，追求真理。太多太多了。无数先贤的前辈的血铸造了非凡铁血的幕后江南。
江南柔顺的背后是匿藏的隐埋的爆发，轰隆隆的血性。老子的道说阴极阳生。江南大概是吧。
江南有无可弥补的伤痕，风波亭的旧事，后主的哀伤，林则徐的虎门，鲁迅的社戏，文革的狂乱。江南啊，风景旧曾谙。
心里的江南如梦幻般，伤痕和热血的江南，柔顺和安然的江南，有太多心事的江南，重合在一起，近，却咫尺天涯；远，却抬手可触。无法琢磨，甚至于分不清柔和刚的界限，混合在一起。江南的魅力，一丝一毫间，经久不衰，如扎根般蔓延。
唉，这江南。
只有理解了路的艰辛才知道母亲痛苦的血迹后的啼哭。——题记
当我在母亲的牵引下，迈出第一步的时候，有一条路就从脚下开始延伸。生活的路，人生的路，就凭这一脚踏响了序曲。
人类的双脚是用来走路的，当我不知不觉降临到人间时，就建立了人与路的关系。从被人牵着走，到牵着他人走，在这个漫长而崎岖的过程中，路，总是在我脚下忠实地躺着。
每个人脚下的路很多，正路与邪路，大路与小路，新路与旧路，直路与弯路，长路与短路，通路与绝路，等等。路在人走，事在人为，就看自己如何去走……“路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。”这是古人对人生之路的认识。人生路遥，步履艰辛。路，总是要走的：耕耘，是农民的路，是教师的路；探索，是科学家的路，是学生的路；开拓，是建设者的路，是愚公精神之路……彩虹的路是绚丽的，但虚幻、短暂；蜗牛的路是艰难的，但无畏、持久；老黄牛的路是泥泞的路，但脚步踏实、坚定……走平坦的路，脚印最浅；走泥泞的.路，脚印最深；不会走自己选择的路的人是可悲的；走自己的路，虽苦犹甜。
路是真理的化身。人对理想的执著追求，不懈奋斗的历史，构成了一部部赞美诗、交响曲，让人回肠荡气。精卫衍微木，将以填沧海”；愚公挖山不止，让七百里方圆的太行、王屋让路，是人类精神上追求真理的宝贵遗产。
路是给人走的。不管是闲庭信步，还是奔驰疆场，路的功能是给脚的自由。人们往往愿意走平坦的、宽阔的、现成的路，正由于如此，我对于那些选择崎岖的、陡峭的、尚未开拓的路的人，更为诚恐诚敬。由于只有不畏艰险、沿着陡峭山路攀登的人，才有希望达到光辉的顶点。他们是逢山开路的英雄，是民族的脊梁和自豪。
世界上任何一条路都是人走出来的。我敬仰不畏艰险开山辟路的愚公精神，我赞美一步一个脚印的执著意志。然而，不尽的路还很长，不因我幸运，不因我成功而终止。回首看，走过的路标已消失在眼帘；抬起头，又眺望远方下一个驿站。尽管曲折不平，尽管步履蹒跚；侧耳听，风从远方送来深情的呼唤；举目望，阳光洒下金色的辉煌……一路走来，我感受到路的内涵和外延。一条路连接着另一条路，一条路平行着另一条路，一条路交叉着另一条路。
不论路长路短都是无限的路，不论路曲路直都是生命的有力一笔。由于有了路，生命才有了明确的意义，才有了丈量的标准，才有了有限与无限的区别，才有了世人评判的依据。
路是生命的延伸；路是理想的航标。让我朝着前方的领地，继续迈出自信的脚步，走下去，让每一步都留下坚实的脚印。
是呀，有个朋友，有个知己，有个伙伴，不计名利恩怨，这样才能活的健康，活的洒脱，活的快乐，就会感到幸福！
我们如何看待对与好？是此事古难全的二者必择其一？还是最终皆可圆的皆大欢喜？于此小叙拙见。
苏轼，一代文豪，游于赤壁之下可与友正襟对坐叙天地之往来，叹人生之须臾，胸怀宽广自是纵贯古今气象，寻常人皆叹难以望其项背；密州出猎更是一句“西北望，射天狼”可以豪气撼动日月星辰。可就是这样一位文章惊海内的大手，又何尝不叹过一句“冯唐易老，李广难封”呢？仕途失运，发配黄州，于他，又何尝不是“我被聪明误了一生”呢？他好吗，当然，只是纸上苍生终究难算命途一二，他还是被“错”误了，连自己都忍不住要哀诫儿女：“唯愿孩儿愚且鲁，无灾无难到公卿。”
再者还如嵇康，魏晋之众难掩瑜光，文章自是不必赘述，狂放自如甚至要放于首位。他倒是什么都肯说，纵使一篇绝交书也是流芳至今，最终却因轻薄了周武孔尊，被司马氏所害，一曲《广陵散》要与他一同魂飞魄散。他好么？当然，知识竹林之风终究不敌朝堂风雨，人们常羡七贤，皆是天地为衣长醉于世，但多如嵇康吧，也还是要书一篇《家诫》告于子女莫学，再被“错”误了。
七贤中还有一位，“阮籍猖狂，岂效穷途之哭”说罢嵇康，怎能不提阮籍。人人服药的时代，独他一人酒中清醒。他是醉了，但还是醒着，看得清时局，纵使发了心中之慨，却仍是要拿一句酒后胡言抵过，才侥幸逃过了权贵的迫害，比起好，他更追求对，老来更加安省，知识做的好的便愈发的少，但被“错”误的就也随着少了，可叹，可笑。
观不来古今，便学何晏之空谈。好与对是否真就难以两全？先生之风，难道没有千古么？他们或许都没有在自己有限的生命中圆满对与好的结局，可苏公之佳话，竹林之逸风，无一不为后世所歌，他们的意义从来不只缩短在过去那短短的几十载，就如同对与好之于我们的意义一般，从不彰于眼前，我相信，好的价值终会显现于对上，切莫心急。
日后再观。
至20xx年18岁的你：
朋友，你好！一想到当你下次再打开这个时光瓶时，日历已经撕完了17本，我就莫名激动起来……什么？你问我日历在电子屏幕上，怎么能撕？难道……你没见过纸质的日历吗？
咳咳咳咳……世界的变化日新月异，所以没关系，我能理解、能理解。
17年后的世界会变成什么样呢？
就像90后们一出生就能看电视、我们00后一出生就拥有了电脑一样，对于你们而言，VR（虚拟现实）装置一定也不陌生吧？同样的，就如90后们把看电视当作理所当然，我们00后把玩电脑当成家常便饭一样，你们一定也觉得戴上VR眼镜观看世界各地的风景名胜、利用它进入到游戏世界里做任务、交朋友是再平常不过的事了吧？
然而不知道你发现了没有，这些被我们认为是理所当然的事，通常都并不是那么地理所当然。
也许你想象不到，“电视”这种在你的世界里或许已经被淘汰了的媒体，是20世纪最伟大的发明之一。从“电视”这个概念的提出，到它开始普及开来，整整用了约半个世纪的时间。而你所熟悉的电脑一开始也并不是如同笔记本这般轻薄的样子，它最开始有整整一个屋子那么大。
这些在你眼里可能已经十分陈旧的媒体，都是伴随着设计师们的永不言弃的钻研精神、乃至全社会科技的发展助力下，才从稚嫩走向成熟的。
所以朋友，你手中平价的VR装置、无处不在的6G网络、还有你家楼下十分便利的无人商店，以及商店中不时能看到的智能机器人服务员们，正是前人们付出了无数努力的结晶。而我可以自信而自豪地告诉你，这所谓的“前人们”中，一定会包括我们这群即将迈入大学校园的00后。
无论未来会经历怎样的磨砺，生于信息时代的我们，一定能将世界推向你所在的这个已经看得到雏形的未来！而我相信，你们也将会在18岁时看到未来的模样，并慢慢从我们手中接过打开新世界大门的钥匙，让世界再变一番模样！
啊，一想到17年后的世界，我不禁有些激动了……在这未来的17年里，会有怎样超乎想象的伟大发明呢？我们的生活将变得怎样丰富多彩呢？
不过我突然又开始有些担心，这些各式各样的便利设施和娱乐工具，会不会如同乱花一般迷了你我的眼呢？
在今天，我们越来越倾向于以“动画”或“视频”的方式来接触新知识、新事物，等到了你的高中时代，可能更会如此。到那时，还有多少人能沉得下心来去读千百年来知识最传统的载体——文字呢？到那时，“小说”会不会都变成了“电视剧”或“电影”，“论文”会不会变成了依附于影像的“时事评论”，而散文则变成了各种各样的“短视频”呢？
倘若世界真变成这样，我会感到非常痛心的。因为我深知，在艺术的世界中，有许多美只藏在文字里，而文章中的许多细节，也需要我们自己去细细咀嚼才能深知其味。
一代人有一代人的际遇和机缘，一代人有一代人的使命和挑战。我们既是时代的弄潮儿，也同样只能顺着时代前进的方向前行。在此祝愿18岁的你我，今后能为往圣继绝学，为万世开太平！
自觉反省，主动反省的，是不会失败的。 ―――题记
在淡淡的春季里反省，是否奋斗? 当你看到翠绿的小草刚冒出嫩芽时，你是否会反省今年的春天你也会像它一样不息吗?反省可以使人奋发向上;当你看到大自然中又盎发出新的生机时，你是否反省自己今年也可以像它一样从失败中苏醒，重新走上成功的道路吗?反省可以使人增添自信;当你看到那群大雁又飞回来时，你是否反省自己要从失败点找起呢?反省可以使人找回弱点。
在浓浓的夏季里反省，中否成功? 当你看到那粉彤彤的月季又亮出眼前时，你是否会反省这个季节的你是否也光彩夺目呢?反省可以使找回亮点;当你看到 那倦倦不劳的知了又开始工作时，你是否反省自己应尽了你的责任吗?
反省可以使人学会负责;当你看见那昙花又是一瞬间中来了又去，你是否反省自己在一瞬间中留下了什么呢?反省可以使人认清自己。 在灿灿的秋季里反省，是否丰收? 当你看到金灿灿的稻穗成熟时，你是否反省自己在前两季中得到了什么呢?反省可以使人看清过程;当你看见那农民伯伯那辛苦的收割时，你是否会反省你收获了什么呢?反省可以使人振作;当你看见那稻苗又一次撒在田地里时，你是否会反省你会成功吗?反省可以使人自立。 在绵绵的冬日里反省，你是否无悔?
在经过三季的播种后，你是否反省自己无悔?反省可以使人认清目标;当你看到那梅花还在风雨中绽开时，你是否会反省你的走过的路无悔吗?反省可以使人更加谦虚;当你看到那一望无际的白雪时，你是否反省你以后会怎样去走向成功?反省可以使人展望未来。 在春日里反省，暖洋洋;在夏日里反省，凉爽爽;在秋日里反省，硕果累累;在冬日里反省，展望前方。
反省可以使我们认清目标，增添自信，明白对与错，成功失败，目标与结尾，过程与成果…… 那么，朋友，请自觉反省，做反省的主人吧!相信辉煌的胜利之一会向你敞开。
时间飞逝如流水，现在的我已站在高三的门槛上了。
曾经无数次幻想自己快点进入高三，因为高三意味着毕业，毕业之后就不会为那些函数几何感到头疼，也不会为那十多本英语书感到无奈，更不会去背那些晦涩难懂的文言文了。曾经的我总觉得时间过得很慢，可如今的我已站在高三的门槛上了。
而我的高三，并不像学哥学姐们说的那样日夜浴血奋战，相反，更多的是一份轻松愉快与好奇。我们不知天高，也不知地厚，肆意挥霍着自己的青春，因青春无形而看不到它的宝贵。日子一天一天地过，而我一天一天地玩，没有什么比玩还重要，没有什么比去操场更着急。无趣无聊无味构成了我目前生活的主线条，可是突然有一天，我看到旁边的同学在认真地默写古诗，不停地背诵英语单词的时候，我心中的压力陡然增加了。
回到家中，长辈们或许会经常看见我们微笑，但我们并非经常快乐。当被告知在高中阶段应踽踽独行地拼搏奋进后，我们开始了寂寞的旅程，却恋上了回忆。期望保留当初喜悦心情的我们，用平实的文字记录引发感触的人或事。一旦沉湎于现实中的苦楚，就回忆过去的甜蜜片段。现在我们回想起以前的那些美好时光，仿佛都在昨天。在我生命中出现的我都还没有做好，时间就过去了。如果我们可以回到以前，现在的我们还会觉得时间过得慢吗？当然不会吧！
我现在已是一名高三的学生了，肩上的担子也会越来越重，背负的责任也很大。我们应该在高三的一年里努力冲刺，珍惜时间。
从小我就有一个梦想，梦想自己有一天能以老师的身份走上三尺讲台，看着我的学生一步步走上进步的阶梯，因此我的目标锁定在师范上。每当自己陷入挫折和困境时，我就会想到自己的梦想，向师范看齐，决不会因困难而放弃。如果一堂课下来，很多人轻松地学会了很多知识，可我怎么也听不懂，我会心里很烦，一个人坐在位子上思考，甚至有时还会准备放弃。当我有了这些念头的时候，我就会提醒自己我的师范梦。我也坚信只要心中有梦，再难再苦，只要努力总会实现的。
高三不仅意味着毕业，还意味着高考，更意味着我们为自己幸福美好的人生而奋斗。加油！努力冲刺吧！
1、 自噬的定义： 细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。2、 自噬的过程： 从一张图片开始： 步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。 步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。 步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。 步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。3 、自噬的特性： 1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。 2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。 3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。 4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别 5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。 6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？）。4 、自噬过程的调控： 从上面总结的自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。 关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有： 抑制类 1）Class I PI3K pathway（PI-phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）与IRS (Insulin receptor substrate)结合，接受胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬） 2）mTOR pathway（mammalian target of rapamycin） mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化,rapamycin是最典型最常用的自噬激动剂. 激活类 1）Class III PI3K 结构上类似于Class I PI3K，但作用相反。3-MA是Class III PI3K的抑制剂,因此3-MA可以作为自噬的抑制剂. 5 、自噬的研究方法： 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有： （一）自噬诱导剂 1）Bredeldin A /Thapsigargin / Tunicamycin ： 模拟内质网应激 2 ）Carbamazepine/L-690，330/ LithiumChloride（氯化锂）： IMPase 抑制剂 （即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶） 3 ）Earle's平衡盐溶液： 制造饥饿 4 ）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3KPathway抑制剂 5 ）Rapamycin：mTOR抑制剂 6 ）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂 （二）自噬抑制剂 1 ）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂 2 ）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂 3 ）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumenalkalizer（溶酶体腔碱化剂）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有： 1）观察自噬体的形成 由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV） 2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬形成：(常用) GFP-LC3单荧光指示体系：由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成。我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。双荧光指示体系：汉恒生物科技（上海）有限公司已开发出用于表达mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒产品。mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。 3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。 自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。 (Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响) 4) 利用Western Blot检测p62蛋白来评价自噬以及自噬流的强弱:起初自噬所降解的底物被认为是随机的,但是后来的研究表明有些蛋白是选择性降解的,在这些蛋白之中研究的最为透彻的是p62蛋白，p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系。 5）MDC或者Cyto-ID染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。 6）Cell Tracker TM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。 6、自噬体的发生： 目前认为，自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网，而是在胞浆中重新生成的，但具体的机制尚不清楚。当beclin-1被活化后，胞浆中先形成很多个membrane source（自噬体膜发生中心），在它们不断扩展的过程中(phagophore到autolysosome)，VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上（VMP1又叫TMEM49，已知唯一与自噬有关的 跨膜 蛋白），同时，MAP1-LC3由胞浆型（即LC3-I）转位到自噬体膜（即LC3-II），LC3这一转变过程可被Western Blot和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。7、自噬与细胞死亡的关系： 有必要说明一下的是，细胞死亡是一个非常复杂的过程，为了研究方便，需进行分类，但我们思考时不要局限于这些 人为的分类，而应注重于现象本身来研究其背后的机制。 一直以来人们从不同角度、用不同方法来观察细胞的死亡，并把细胞的死亡方式分为2类：坏死和凋亡，因为两者有着明显的区别，其中最主要的区别之一就是细胞膜的通透性——坏死细胞的细胞膜丧失了完整性，内容物被释放出来，染料可自由进入细胞，而凋亡细胞保持完整，无内容物释放，染料也被排斥。很多实验亦根据这一原理来设计以区分坏死和凋亡，这将在后面一一介绍，如同刚刚说明的那样，这些实验只能说明细胞膜的通透性（必要条件，不是充分必要条件），而不能用来证实坏死细胞或凋亡细胞。一般认为坏死是被动的，不可控的，而凋亡是主动的，可控的。为了强调这一点，凋亡被定义为程序性细胞死亡（program celldeath，PCD）。但无论是坏死还是凋亡，都是一个过程，是需要时间的（尤其是凋亡，从启动到完成，细胞要执行很多反应），而且细胞死亡后都有“尸体”。在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩（pyknosis）, 核破裂（karyorhexis）、细胞皱缩（shrinkage）、没有凋亡小体的形成等，被称为自噬样细胞死亡（autophagic celldeath，ACD），它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为Type II cell death，相应的，凋亡为Type I cell death，坏死为Type III cell death。尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是Cell death by autophagy（自噬引起死亡）还是Cell death with autophagy（死亡时有自噬发生，但不是直接原因）？对此，自噬研究领域“大牛”级专家Levine Beth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。由于在形态学上2者无明显区别，但通过阻断自噬，观察细胞的结局可区分开来：Cell death by autophagy细胞存活，而Cell death with autophagy细胞死亡。8、自噬与肿瘤的关系： 与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此， 自噬具有维持细胞自稳的功能 ；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说， 自噬就是一个 “ 备用仓库 ” 。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，这一现象被称为“自噬潮”（autophagic flux），广泛用于自噬形成的监测。自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持，有利于细胞的存活。 鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大好处： 1 ）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。 2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会促进坏死），但具体机制尚不清楚。自噬与肿瘤的关系可能是双重的。①对不同的细胞，自噬的作用可能不同。②相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。③在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬的作用可能不同。肿瘤生长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括 Beclin 1在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。④对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。自噬功能不全的细胞易于坏死，但是坏死组织产生的细胞因子（包括部分生长因子）反而会促进肿瘤的生长。上述各种假设均有待证实。肿瘤为细胞分化障碍性的疾病已得到肯定，但自噬在肿瘤细胞的分化抑制过程中起着什么样的作用，自噬水平提高是抑制分化甚至导致去分化还是促进分化等问题尚未解决。 9、在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位： Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。 LysoTrackerTM探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。 pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。 MitoTracker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。 Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。 Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔 Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeabilize），可采用处理 自噬与细胞死亡经常需一起考虑，下面介绍一些检测细胞死亡的方法： 1）△ψmdissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM发红色荧光，DiOC6（3）发绿色荧光。 2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰丝氨酸外翻）：Annexin V-FITC（绿色）染细胞膜。 3）检测线粒体产生的ROS：无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），发红色荧光。NAO（nonylacridine orange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。 4）线粒体IMS蛋白的释放：AIF，细胞色素c，分别用荧光二抗染色。 5）Capase 3a 染色：用荧光二抗染色，胞浆弥散分布。 6）细胞膜完整性检测：DAPI（蓝色）、Hoechst 33342或PI（红色）染核。胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用annexin V。 10、如何用实验区分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy？ 第一步：利用上述方法证实细胞死亡 第二步：证实细胞死亡前发生了自噬 第三步：在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡 第四步：利用遗传学手段（反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具药抑制自噬 第五步：细胞存活则为Cell death by autophagy，反之，细胞死亡则为Cell death with autophagy。 自噬的抑制根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下： 1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002 也可用作Autophagy的抑制剂。 2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。 3）对溶酶体降解的抑制:自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。E64d和Pepstatin A均属于蛋白酶抑制剂，二者以1：1的比例联用可以抑制自噬。有研究表明，在结肠癌细胞系中联用E64d及Pepstatin A，可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展，而自噬体的形成并没有受到明显影响。11 、自噬领域的大牛们： 1）YoshinoriOhsumi博士。日本科学家，克隆了第一个酵母自噬基因Atg1以及LC3，主要成果在酵母模型下自噬研究； 2 ）Daniel J. Klionsky博士。美国科学家，主要成果在酵母模型的自噬研究。最早在《Science》上发表综述介绍自噬，2005年创办了第一本自噬杂志《Autophagy》；2007年举办了第一次自噬国际会议，为自噬的宣传做了大量工作。 3 ）Noboru Mizushima博士。日本科学家，2001年主要报道了Atg5的功能，被认为是哺乳动物分子机制研究的第一环，以及参与克隆自噬标志物LC3，而且制备了一些ATG基因敲除老鼠以及LC3转基因老鼠； 4 ）Beth Levine博士。美国科学家，首先克隆了第一个哺乳动物自噬基因Beclin 1； 5 ）Guido Kroemer博士。法国科学家，是细胞凋亡和死亡领域中引用率第一的科学家。在细胞凋亡研究中作出了卓越贡献而且涉猎及其广泛。目前也从事自噬研究，例如p53，Bcl2家族与细胞自噬。 6 ）Tamotsu Yoshimori博士。日本科学家，2000年克隆了目前广泛使用的自噬标志物LC3文章的通讯作者，而且也参与了2010年ATG5机制研究，是通讯作者之一。在方法学上也有关键贡献。目前主要研究ATG14和ATG16。值得注意的是，上述三位日本科学家合作紧密，克隆了目前大部分的ATG基因，经常共享文章通讯作者。 7 ）Patrice Codogno博士。法国科学家，2000年首先证实了PI3K信号通路在自噬的作用，I型抗自噬，III型促自噬，是自噬信号通路的开拓者。 8 ）Ana Maria Cuervo博士。美国科学家，是分子伴侣自噬的开拓者。 9 ）David Rubinsztein博士。英国科学家，2004年首次报道了mTOR与自噬的关系，抑制mTOR促进自噬。目前利用rapamycin诱导自噬成为经典模型之一。2010年Nature的报道首次证实了自噬对mTOR的负反馈调节。 12 、自噬信号通路： 1 ） KEGG 2 ） Abcam 3 ） CST 4) Enzo 13、我在做自噬课题中的一些心得： 自噬小体的增多有两种可能：一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢？自噬体增多，也就是“自噬潮”出现的原因一是形成增多，二是与溶酶体融合受阻（如使用了氢化氯喹或氯喹，另外，溶酶体的酶抑制剂和质子泵抑制剂的使用亦有可能影响溶酶体与自噬体或异噬泡的融合），使自噬体不能降解而积聚，这种积聚造成的自噬体增多的效应要大于自噬体诱导剂效应的数倍之多。鉴于这样的原因，单纯的GFP-LC3荧光斑点增多不足以作为自噬激活的证据，可联用多个方法来判断： 1 ）加用自噬体与溶酶体融合的抑制剂，如氯喹，观察自噬潮的变化。 2 ）或加用LC3和溶酶体示踪物在荧光显微镜下观察共定位情况。 3 ）或Knockdown掉LAMP-2基因（溶酶体膜蛋白）。 4 ）检测胞浆长寿蛋白的降解。 WesternBlot 检测LC3时除了上述的原因外，还有几个需考虑到的地方： 1 ）抗体的亲和力：有报道认为LC3抗体对II型LC3的亲和力较高 2 ）结合于自噬体内层膜的LC3-II在与溶酶体结合后被降解。 3 ）自噬过程很快，一个自噬体从产生到降解仅需2~3个小时或更短，其中自噬体形成阶段更迅速，数分钟即可完成，而溶酶体降解阶段耗时相对较长。因此，设置多个检测时间点（time frame）是非常重要的。
右哉 [细胞自噬] 2016-01-07
最近自噬的研究都很火，耐药不耐药，凋亡不凋亡的都开始往上扯了。
这篇文章的题目是："Ulinastatin Reduces the Resistance of Liver Cancer Cells to Epirubicin by Inhibiting Autophagy"，基本上可以作为入门级自噬研究的参考模板了。
文章思路是这样的：首先文章证明了EPI能诱导肝癌细胞自噬，而UTI能抑制这样的自噬；然后UTI能促进EPI诱导的细胞凋亡；接着证明UTI是抑制自噬从而促进了EPI诱导的凋亡；然后证明了UTI是通过NF-kB信号通路起到了这样的作用；最后做了一下成瘤实验。
我们就看第一个Fig，就基本能了解自噬他们究竟做了点啥。
自噬研究基本可以分这样几个层次：
1.证明自噬参与了你的研究表型：****western检测LC3，p62；LC3双荧光测细胞自噬流；电镜观测自噬；
自噬形成时胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
但LC3的抗体会对LC3-II有更高的亲和力，所以往往会造成假阳性。所以通常会使用LC3的亚细胞结构定位来辅助实验。比如这篇文章所采用的就是HanBio Inc.（汉恒生物）的****mRFP-GFP-LC3的腺病毒进行分析的。
2.证明自噬在你的表型中起了关键作用：****加自噬抑制剂3-MA，激动剂rapamycin等，然后检测表型（功能）；
这里就用到了两种自噬抑制剂：3-MA和CQ（Chloroquine）。
3.找到表型与自噬衔接的分子：****检测自噬通路如pI3K 通路，Beclin-1，ATG家族各成员,看看哪个与表型呈现正相关变化;
4.基因操作3中的分子,检测自噬和表型****：说明该分子在衔接自噬和表型中的作用机制;
这一点需要运用到的也就是柯霍氏法则和回复实验。
…华丽丽的分割线…
李莫愁博士：****而普通的自噬研究，也就是这样一个模式：（感谢汉恒生物的蔡博士为我们整理）
自噬表型研究中，较为常用的就是采用汉恒的mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒，对细胞进行了感染。mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
就像是这样：
（2014，Kidney International，IF=）
（该实验所用自噬工具为汉恒生物Ad-mRFP-GFP-LC3双标腺病毒）
右哉 [细胞自噬] 2016-01-07
最近自噬的研究都很火，耐药不耐药，凋亡不凋亡的都开始往上扯了。
这篇文章的题目是："Ulinastatin Reduces the Resistance of Liver Cancer Cells to Epirubicin by Inhibiting Autophagy"，基本上可以作为入门级自噬研究的参考模板了。
文章思路是这样的：首先文章证明了EPI能诱导肝癌细胞自噬，而UTI能抑制这样的自噬；然后UTI能促进EPI诱导的细胞凋亡；接着证明UTI是抑制自噬从而促进了EPI诱导的凋亡；然后证明了UTI是通过NF-kB信号通路起到了这样的作用；最后做了一下成瘤实验。
我们就看第一个Fig，就基本能了解自噬他们究竟做了点啥。
自噬研究基本可以分这样几个层次：
1.证明自噬参与了你的研究表型：****western检测LC3，p62；LC3双荧光测细胞自噬流；电镜观测自噬；
自噬形成时胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
但LC3的抗体会对LC3-II有更高的亲和力，所以往往会造成假阳性。所以通常会使用LC3的亚细胞结构定位来辅助实验。比如这篇文章所采用的就是HanBio Inc.（汉恒生物）的****mRFP-GFP-LC3的腺病毒进行分析的。
2.证明自噬在你的表型中起了关键作用：****加自噬抑制剂3-MA，激动剂rapamycin等，然后检测表型（功能）；
这里就用到了两种自噬抑制剂：3-MA和CQ（Chloroquine）。
3.找到表型与自噬衔接的分子：****检测自噬通路如pI3K 通路，Beclin-1，ATG家族各成员,看看哪个与表型呈现正相关变化;
4.基因操作3中的分子,检测自噬和表型****：说明该分子在衔接自噬和表型中的作用机制;
这一点需要运用到的也就是柯霍氏法则和回复实验。
…华丽丽的分割线…
李莫愁博士：****而普通的自噬研究，也就是这样一个模式：（感谢汉恒生物的蔡博士为我们整理）
自噬表型研究中，较为常用的就是采用汉恒的mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒，对细胞进行了感染。mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
就像是这样：
（2014，Kidney International，IF=）
（该实验所用自噬工具为汉恒生物Ad-mRFP-GFP-LC3双标腺病毒）
自噬（autophagy）被认为是维持细胞稳态的关键过程，也是对等压力源的反应，如营养缺乏，这可能会危及细胞的生存。当细胞接触到这些压力源时，原本在低水平发生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就会被大幅度上调。 这种上调会增加了细胞的吸收和降解，将大分子释放回胞质中以驱动必须的代谢反应并产生能量。
在正常和压力条件下，自噬对细胞健康的贡献，意味着这种严格调控和精确协调过程的重要生理和病理作用。事实上， 自噬在哺乳动物的发育过程中被发现是有用的。 此外，最近的研究发现自噬是各种疾病和病症的重要调节器。探索自噬在发育和疾病中的参与，对于更全面地了解这一途径的作用至关重要，并且可能对保持健康或治疗疾病有影响。
自噬的研究已经成为如今医学研究的常客，发文量也十分巨大，成为常规生物学现象来研究，但是有一些实验上的技巧值得探讨一二，例如一些试剂的使用等等
1、自噬相关试剂的使用。
①MDC: 取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;
②Rapamycin: 用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;
400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;
③3-MA: 首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L;PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成；
用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主
④Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h
sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些
⑤无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了。
⑥Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
⑦sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存
不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。
⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。
1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol；
2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。
2、自噬诱导剂
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的药物有：
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
(5) Rapamycin：mTOR抑制剂
(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
3、自噬抑制剂
(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂
(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:T7765 ;溶于DMSO中配成储存液,使用时DMSO终体积浓度不超过1/1000。
3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:M9281;溶于灭菌超纯水制成储存液。
氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司产品,货号:C6628;溶于灭菌超纯水中制成存液。
雷帕霉素(rapamycin), in DMSO, Sigma-Aldrich 公司产品,货号:R8781;
4、MDC染色焚光显微镜检测细胞自睡
单丹黄酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一种突光染料,被用作自吞泡的示踪剂。具体操作步骤如下:
(1)将处于对数生长期的HepG2细胞按常规方法消化后接种于6孔板,每孔接种1x106个细胞;
(2)细胞密度达到60%-70%时,弃去培养液,小心用PBS洗1遍,分别用含TG浓度为0、、1 nM的培养基及含Rapamycin (终浓度1 pM)的培养基继续培养24 h;
(3)弃上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(终浓度50 nM)的培养基于37 V、5% CCh的恒温培养箱中避光温育20 min;
(4)取出六孔板置于劳光显微镜下,Ih内观察细胞自唾发生情况并拍照。
5、流式细胞术检测细胞自噬发生率
(1)取对数生长期的HepG2细胞,接种于6孔板,培养24h之后,分别用含TG浓度为0、1、2、4、8uM的培养基继续培养24h和的TG作用不同时间(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,将上清收集到4 ml的离心管中;
(2)每孔加入2ml含MDC(终浓度50nM)的MEM培养基,于37°C、5%0?的恒温培养箱中避光孵育30 min;
(3)将收集的上清2000rpm,离心5min;
(4)弃掉上清,每管加入500ul含MDC(终浓度50 uM)的MEM培养基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;
(5)取出六孔板,PBS洗2次,的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混匀收集到的离心管中,2000 rpm.离心5 min;
(6)弃掉上清,加1ml的PBS重悬,2000rpm,离心5 min;
(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;
(8)鲜育完的上清,2000rpm,离心5 min;
(9)弃掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到 ml的离心管中,2000 rpm,离心5 min;
(10)重复步骤(6)和(7);
(11)将上述两个相同浓度或相同时间点的两管混勾,过300目铜网上机检测。流式细胞
仪以488nm激发波长测定MDC染色的荧光强度。
LC3B WB: 1:2000
条件是15% SDS-PAGE, 正常跑胶至下沿即可，200mA 湿转45min 正常的PVDF，5%牛奶封闭1h，4C过夜摇动孵育，洗抗体3*5min即可
LC3B的Western-blot检测，配置的15%的分离胶，湿转250mA，60min
转自科研者言公众号 基金知识##细胞自噬的相关实验和方法，对实验很有用
扣扣号是1135开头的，中间是452，结尾是139。他们做这个服务的
慢性白血病:是一种造血系统的恶性肿瘤,系骨髓中各系列细胞呈慢 性弥漫性恶性增生并浸润全身各组织,增生的细胞常无明显的成熟障 碍。 • 根据细胞类型分为: 慢性粒细胞白血病 慢性粒单细胞白血病 慢性淋巴细胞白血病 幼淋巴细胞白血病 毛细胞白血病等 主要内容 • 慢性粒细胞白血病 • • • • • 1.疾病概述 2.病因及发病机制 3.临床表现分期 4.诊断标准及实验室检查 5.治疗 1 CML疾病概述 CML疾病概述 1 慢性粒细胞白血病 (简称慢粒)亦称 为慢性髓细胞白血 病(CML),是一 种起源于多能干细 胞的髓系增生性肿 瘤,粒细胞生成显 著增多,而清除率 相对缓慢,造成粒 细胞在体内积聚。 2 特点:外周血白细胞 总数增加,骨髓和外 周血中粒细胞显著增 多,脾脏明显肿大, 多因急性变而死亡 3 CML在不同国家、不同地 区和不同种族发病不尽相 同,在欧美西方国家,发 病率约为万。 在 我国则约为 万,占白血病病人的15%, 中位发病率年龄为45-50 岁,男性多于女性 2 CML病因及发病机制 病因及发病机制 1 较公认的因素 是电离辐射 (放射性药物、 放射治疗、X线 诊断和治疗及γ 射线的接触), 暴露于辐射的 人群有较高的 CML发病率 2 化学因素:常 年接触苯类化 合物以及某些 药品,如保泰 松、氯霉素及 烷化剂等,可 诱发CML 3 病毒因 素:RNA 肿瘤病毒 4 遗传:尚待进 一步研究,当 母体患慢粒时, 妊娠的下一代 子女可不受影 响,孪生兄弟 一人患CML, 另一人未发现 相同的遗传学 异常,也不会 患此病。 3 CML临床表现 临床表现 • 起病缓慢,其自然病程包括无症状 期、慢性期、加速器及急变期4个阶 段,多数患者是在症状出现之后方 去就诊并得以诊断。 只有极少数人 在体检和因为其他原因检查血液时 才发现血液异常,此时脾脏可能已 有轻度肿大或不大。 查看更多
慢性白血病:是一种造血系统的恶性肿瘤,系骨髓中各系列细胞呈慢性弥漫性恶性增生并浸润全身各组织,增生的细胞常无明显的成熟障碍。
嗯哼 楼主想要多少（zi）呐，有木有 小题目Y
细胞生物是指所有具有细胞结构的生物。这是我为大家整理的关于细胞生物学术论文，仅供参考!
细胞因子的生物学活性
关键字： 细胞因子
细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。
一、免疫细胞的调节剂
免疫细胞之间存在错综复杂的调节关系，细胞因子是传递这种调节信号必不可少的信息分子。例如在T-B细胞之间，T细胞产生IL-2、4、5、6、10、13，干扰素γ等细胞因子刺激B细胞的分化、增殖和抗体产生;而B细胞又可产生IL-12调节TH1细胞活性和TC细胞活性。在单核巨噬细胞与淋巴细胞之间，前者产生IL-1、6、8、10，干扰素α，TNF-α等细胞因子促进或抑制T、B、NK细胞功能;而淋巴细胞又产生IL-2、6、10，干扰素γ，GM-CSF，巨噬细胞移动抑制因子(MIF)等细胞因子调节单核巨噬细胞的功能。许多免疫细胞还可通过分泌细胞因子产生自身调节单核巨噬细胞的功能。许多免疫细胞还可通过分泌细胞因子产生自身调节作用。例如T细胞产生的IL-2可刺激T细胞的IL-2受体表达和进一步的IL-2分泌，TH1细胞通过产生干扰素γ抑TH2细胞的细胞因子产生。而TH2细胞又通过IL-10、IL-4和IL-13抑制TH1细胞的细胞因子产生。通过研究细胞因子的免疫 网络调节，可以更好地理解完整的免疫系统调节机制，并且有助于指导细胞因子做为生物应答调节剂(biologicalresponsemodifier’BRM)应用于临床 治疗免疫性疾病。图4-1 细胞因子与TH1、TH2的相互关系(略)
二、免疫效应分子
在免疫细胞针对抗原(特别是细胞性抗原)行使免疫效应功能时，细胞因子是其中重要效应分子之一。例如TNFα和TNFβ可直接造成肿瘤细胞的凋零(apoptosis)’使瘤细胞DNA断裂’细胞萎缩死亡;干扰素α、β、γ可干扰各种病毒在细胞内的复制，从而防止病毒扩散;LIF可直接作用于某些髓性白血病细胞，使其分化为单核细胞，丧失恶性增殖特性。另有一些细胞因子通过激活效应细胞而发挥其功能，如IL-2和IL-12刺激NK细胞与TC细胞的杀肿瘤细胞活性。与抗体和补体等其它免疫效应分子相比，细胞因子的免疫效应功能，因而在抗肿瘤、抗细胞内寄生感染、移植排斥等功能中起重要作用。
三、造血细胞刺激剂
从多能造血干细胞到成熟免疫细胞的分化发育漫长道路中，几乎每一阶段都需要有细胞因子的参与。最初研究造血干细胞是从软琼脂的半固体培养基开始的，在这种培养基中，造血干细胞分化增殖产生的大量子代细胞由于不能扩散而形成细胞簇，称之为集落，而一些刺激造血干细胞的细胞因子可明显刺激这些集落的数量和大小因而命名为集落刺激因子(CSF)。根据它们刺激的造血细胞种类不同有不同的命名，如GM-CSF、G-CSF、M-CSF、multi-CSF(IL-3)等。目前的研究表明，CSF和IL-3是作用于粒细胞系造血细胞，M-CSF作用于单核系造血细胞，此外Epo作用于红系造血细胞，IL-7作用于淋巴系造血细胞，IL-6、IL-11作用于巨核造血细胞等等。由此构成了细胞因子对造血系统的庞大控制 网络。某种细胞因子缺陷就可能导致相应细胞的缺陷，如肾性贫血病人的发病就是肾产生Epo的缺陷所致，正因如此，应用Epo 治疗这一疾病收到非常好的效果。目前多种刺激造血的细胞因子已成功地用于临床血液病，有非常好的 发展前景。
四、炎症反应的促进剂
炎症是机体对外来刺激产生的一种病理反应过程，症状表现为局部的红肿热痛，病理检查可发现有大量炎症细胞如粒细胞、巨噬细胞的局部浸润和组织坏死，在这一过程中，一些细胞因子起到重要的促进作用，如IL-1、IL-6、IL-8、TNFα等可促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放’可直接刺激发热中枢引起全身发烧’IL-8同时还可趋化中性粒细胞到炎症部位’加重炎症症状.在许多炎症性疾病中都可检测到上述细胞因子的水平升高.用某些细胞因子给动物注射’可直接诱导某些炎症现象’这些实验充分证明细胞因子在炎症过程中的重要作用.基于上述理论研究结果’目前已开始利用细胞因子抑制剂治疗炎症性疾病’例如利用IL-1的受体拮抗剂(IL-1receptor antagonist’IL-lra)和抗TNFα抗体治疗败血性休克、类风湿关节炎等，已收到初步疗效。
五、其它
许多细胞因子除参与免疫系统的调节效应功能外，还参与非免疫系统的一些功能。例如IL-8具有促进新生血管形成的作用;M-CSF可降低血胆固醇IL-1刺激破骨细胞、软骨细胞的生长;IL-6促进肝细胞产生急性期蛋白等。这些作用为免疫系统与其它系统之间的相互调节提供了新的证据。
细胞衰老的分子生物学机制
摘要：细胞衰老(cellular aging)是细胞在其生命过程中发育到成熟后，随着时间的增加所发生的在形态结果和功能方面出现的一系列慢性进行性、退化性的变化。细胞衰老是基因与环境共同作用的结果，是细胞生命活动过程的客观规律。为研究细胞衰老分子生物学机制，本文就此展开研究。
关键词：细胞衰老;分子生物学;机制研究
细胞的衰老和死亡与个体的衰老和死亡是两个不同的概念，个体的衰老并不等于所有细胞的衰老，但是细胞的衰老又是同个体的衰老紧密相关的。细胞衰老是个体衰老的基础，个体衰老是细胞普遍衰老的过程和结果。
细胞衰老是正常环境条件下发生的功能减退，逐渐趋向死亡的现象。衰老是生界的普遍规律，细胞作为生物有机体的基本单位，也在不断地新生和衰老死亡。生物体内的绝大多数细胞，都要经过增殖、分化、衰老、死亡等几个阶段。可见细胞的衰老和死亡也是一种正常的生命现象。我们知道，生物体内每时每刻都有细胞在衰老、死亡，同时又有新增殖的细胞来代替它们。
衰老是一个过程，这一过程的长短即细胞的寿命，它随组织种类而不同，同时也受环境条件的影响。高等动物体细胞都有最大增殖能力(分裂)次数，细胞分裂一旦达到这一次数就要死亡。各种动物的细胞最大裂次数各不相同，人体细胞为50～60次。一般说来，细胞最大分裂次数与动物的平均寿命成正比。通过细胞衰老的研究可了解衰老的某些规律，对认识衰老和最终找到延缓或推迟衰老的方法都有重要意义。细胞衰老问题不仅是一个重大的生物学问题，而且是一个重大的社会问题。随着科学发展而不断阐明衰老过程，人类的平均寿命也将不断延长。但也会出现相应的社会老龄化问题以及呼吸系统疾病、心血管系统疾病、脑血管病、癌症、关节炎等老年性疾病发病率上升的问题。因此衰老问题的研究是今后生命科学研究中的一个重要课题。
1 细胞衰老的特征
科学研究表明，衰老细胞的细胞核、细胞质和细胞膜等均有明显的变化：①细胞内水分减少，体积变小，新陈代谢速度减慢;②细胞内酶的活性降低;③细胞内的色素会积累;④细胞内呼吸速度减慢，细胞核体积增大，核膜内折，染色质收缩，颜色加深。线粒体数量减少，体积增大;⑤细胞膜通透性功能改变，使物质运输功能降低。形态变化总体来说老化细胞的各种结构呈退行性变化。
衰老细胞的形态变化表现有：①核：增大、染色深、核内有包含物;②染色质：凝聚、固缩、碎裂、溶解;③质膜：粘度增加、流动性降低;④细胞质：色素积聚、空泡形成;⑤线粒体：数目减少、体积增大;⑥高尔基体：碎裂;⑦尼氏体：消失;⑧包含物：糖原减少、脂肪积聚;⑨核膜：内陷。
2 分子水平的变化
①从总体上DNA复制与转录在细胞衰老时均受抑制，但也有个别基因会异常激活，端粒DNA丢失，线粒体DNA特异性缺失，DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低;②mRNA和tRNA含量降低;③蛋白质含成下降，细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应，导致蛋白质稳定性、抗原性，可消化性下降，自由基使蛋白质肽断裂，交联而变性。氨基酸由左旋变为右旋;④酶分子活性中心被氧化，金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丢失，酶分子的二级结构，溶解度，等电点发生改变，总的效应是酶失活;⑤不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联，膜的流动性降低。
3 细胞衰老原因
迄今为止，细胞衰老的本质尚未完全阐明，难以给明确的定义，只能根据现有的认识，从不同的角度概括细胞衰老的内涵。细胞衰老是各种细胞成分在受到内外环境的损伤作用后，因缺乏完善的修复，使“差错”积累，导致细胞衰老。根据对导致“差错”的主要因子和主导因子的认识不同，可分为不同的学说，这些学说各有其理论基础和实验证据[1]。
差错学派 有以下七种学说，有代谢废物积累学说、大分子交联学说、自由基学说、体细胞突变学说、DNA损伤修复学说、端粒学说、生物分子自然交联说等。其中最主要的自由基学说和端粒学说。
自由基学说 自由基是一类瞬时形成的含不成对电子的原子或功能基团，普遍存在于生物系统。其种类多、数量大，是活性极高的过渡态中间产物。正常细胞内存在清除自由基的防御系统，包括酶系统和非酶系统。前者如：超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)，非酶系统有维生素E，醌类物质等电子受体。机体通过生物氧化反应为组织细胞生命活动提供能量，同时在此过程中也会产生大量活性自由基。自由基的化学性质活泼，可攻击生物体内的DNA、蛋白质和脂类等大分子物质，造成损伤，如DNA的断裂、交联、碱基羟基化。实验表明DNA中OH8dG(8-羟基-2‘-脱氧鸟苷)随着年龄的增加而增加。OH8dG完全失去碱基配对特异性，不仅OH8dG被错读，与之相邻的胞嘧啶也被错误复制。大量实验证明实，超氧化物岐化酶与抗氧化酶的活性升高能延缓机体的衰老。Sohal等(1994、1995)，将超氧化物岐化酶与过氧化氢酶基因导入果蝇，使转基因株比野生型这两种酶基因多一个拷贝，结果转基因株中酶活性显著升高，平均年龄和最高寿限有所延长。
英国学者提出的自由基理论认为自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。自由基就是一些具有不配对电子的氧分子，它们在机体内漫游，损伤任何于其接触的细胞和组织，直到遇到如维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、OPC(原花青素)之类的生物黄酮等抗氧化剂将其中和掉或被机体产生的一些酶(如SOD)将其捕获。自由基可破坏胶原蛋白及其它结缔组织，干扰重要的生理过程，引起细胞的DNA突变。此外还可引起器官组织细胞的破坏与减少[2]。例如神经元细胞数量的明显减少，是引起老年人感觉与记忆力下降、动作迟钝及智力障碍的又一重要原因。器官组织细胞破坏或减少主要是由于自由基因突变改变了遗传信息的传递，导致蛋白质与酶的合成错误以及酶活性的降低。这些的积累，造成了器官组织细胞的老化与死亡。
生物膜上的不饱和脂肪酸易受自由基的侵袭发生过氧化反应，氧化作用对衰老有重要的影响，自由基通过对脂质的侵袭加速了细胞的衰老进程[3]。 自由基作用于免疫系统，或作用于淋巴细胞使其受损，引起老年人细胞免疫与体液免疫功能减弱，并使免疫识别力下降出现自身免疫性疾病。
端粒学说 染色体两端有端粒，细胞分裂次数多，端粒向内延伸，正常DNA受损。
遗传学派 认为衰老是遗传决定的自然演进过程，一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命，而细胞寿命又决定种属寿命的差异，而外部因素只能使细胞寿命在限定范围内变动。
参考文献：
[1]郭齐，李玉森，陈强，等.脱氧核苷酸钠抗人肾脏细胞衰老的分子机制[J].中国老年学杂志，2013，33(15)：3688-3690.
[2]胡玉萍，吴建平.细胞衰老与相关基因的关系[J].中外健康文摘，2012，09(14)：35-37.
[3]孔德松，魏东华，张峰，等.肝纤维化进程中细胞衰老的作用及相关机制的研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志，2012，26(05)：688-691.
其实现在细胞生物学研究有四大热点：第一,细胞骨架；第二，细胞信号转导及其第二信使的信号放大调节；第三，细胞的增殖和调控及其癌变；第四，细胞的衰老和凋亡，并强调与信号和癌变的联系性。总体上来说，现在细胞生物学研究就是这么四个热点，其他的就是这四个大的方面的边缘延伸。
细胞分化使细胞功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率，分化是进化的表现。细胞生长是植物个体生长的基础。
细胞分化的实质：组织特异性基因在时间和空间上差异表达的结果。其表达主要由调控蛋白所启动。
一般认为细胞核内含有该种生物的全套遗传信息。在条件具备时，它可使所在细胞发育分化为由各种类型细胞所组成的完整个体。
如将胡萝卜根的韧皮部小块在含有椰乳的培养基中培养，这些在正常情况下不分裂的细胞会长成组织团块，脱落下来的游离细胞能形成幼芽。
更直接的证据是从培养的烟草，髓部小块形成的组织团块上取脱落的细胞，单个分离培养能得到有根和叶的幼芽，再移植到土壤中，会长出开花的植物。即从单个植物体细胞长出了整棵植物，证明体细胞的核具有全能性。
扩展资料：
细胞分化是稳定的变化：
正常情况下，细胞分化是稳定、不可逆的。一旦细胞受到某种刺激发生变化，开始向某一方向分化后，即使引起变化的刺激不再存在，分化仍能进行，并可通过细胞分裂不断继续下去。这种变化不同于各种生理活动，如激素刺激等所引起的细胞变化，后者在刺激作用消失以后，细胞又将恢复到原来的状况。
细胞生物学的研究热点：细胞生长与细胞分化、细胞增殖与细胞周期的调控、细胞的衰老与死亡、细胞工程、干细胞及其应用。
1、细胞的生长，主要是指细胞体积的增大，细胞分化完成后并不是所有的细胞都有生长的过程，大多数的组织器官都是通过不断的细胞分裂以增加细胞数量的方式来实现器官生长，只有很少数细胞（像神经元细胞）是通过增大细胞体积的方式来实现器官生长的，随着个体的不断发育，神经元细胞，特别是轴突的部分也要不断的伸长。
2、细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。
多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。
3、细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。
5、细胞衰老（cell aging）是指细胞在执行生命活动过程中，随着时间的推移，细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。细胞的生命历程都要经过未分化、分化、生长、成熟、衰老和死亡几个阶段。衰老死亡的细胞被机体的免疫系统清除，同时新生的细胞也不断从相应的组织器官生成，以弥补衰老死亡的细胞。细胞衰老死亡与新生细胞生长的动态平衡时维持机体正常生命活动的基础。
参考资料来源：百度百科-干细胞
参考资料来源：百度百科-细胞工程
参考资料来源：百度百科-细胞衰老