收稿日期：2007-10-25基金项目：深圳市科技和信息局基金资助项目作者简介：王丹（1982-），女，辽宁本溪人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。注：雷江丽为通讯作者。大花美人蕉茎尖组织培养技术研究王 丹1,2，雷江丽2，吴燕民3，吕 慧2，郁继华1(1.甘肃农业大学 农学院，甘肃 兰州 730070；2.深圳市园林科学研究所，广东 深圳 518003；3.中国农业科学院 生物技术研究所，北京 100081)摘 要：以大花美人蕉（Canna×generalis）根茎茎尖为外植体进行组织培养技术研究，筛选出芽诱导适宜的培养基为MS + 6-BA （单位下同）+ TDZ ；MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基能较好地诱导分化出丛生芽, 继代增殖培养中与MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基交替使用可减少畸形芽，增殖系数达；适宜的生根培养基为MS + 6-BA + NAA ，生根率达，且植株生长健壮，移栽易成活。关键词：大花美人蕉；茎尖；组织培养中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2008)01-0033-04Research on Shoot-tip Culture of Canna×generalisWANG Dan1,2, LEI Jiang-li2, WU Yan-min3, LÜ Hui2, YU Ji-hua1( of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu China; Institute of LandscapeGardening, Shenzhen 518003, Guangdong China; Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Beijing 100081, China)Abstract: The paper mainly studied on tissue culture of Canna×generalis with the stem tips asexplants. The results showed that the bud inoculation medium was MS + 6-BA ; the best of clump shoot induction and differentiation medium was MS + 6-BA +TDZ + NAA ; using MS + 6-BA + TDZ + NAA asproliferation medium, an optimal proliferation rate was obtained. When the two kinds of mediumused alternatively, the effect was better. The optimum rooting medium was MS + 6-BA +NAA , the rate of rooting could reach , and cultured in this medium, the plant grewwell and easy to words: Canna×generalis; shoot-tip; tissue culture大花美人蕉(Canna×generalis)属美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的园艺杂交种[1]，是多年生喜光宿根草本花卉，原产美洲热带和非洲等地。其枝叶茂盛、花朵艳丽、姿态优美、花期长，在深圳地区几乎全年开花，是配置大型花坛的优良品种。大花美人蕉不仅观赏价值高，而且能吸收硫、氯、氟、汞等有害物质，具有净化空气、保护环境的作用，因此，世界许多城市的园林绿化中都广泛应用。美人蕉传统的繁殖方式主要采用分切地下根茎的方法，繁殖速度慢、增殖效率低，而且连续营养繁殖造成病毒积累致使病毒病在各地相当普遍，严重影响其观赏价值。利用茎尖组织培养进行脱毒试管苗快繁，是目前大力繁殖与推广美人蕉的主要手段。关于美人蕉组织培养的研究报道较少[2,3]，本研究探索其组织培养高效的再生体系，以期为品种提纯复壮及遗传转化、性状改良奠定基础。2008,37(1): Plant Science第·34· 37 卷1 材料与方法 材料供试材料为目前城市绿化中普遍应用的大花美人蕉‘President’品种。 外植体选择与处理选择生长健壮、无病虫害的优良母株，挖取带芽胞的根茎，去除表面老皮并用肥皂水清洗。用75%乙醇棉擦拭，然后采用不同的消毒剂及处理时间（升汞10min、2%次氯酸钠10min、2%次氯酸钠20min、2%次氯酸钠 + 升汞5min、2%次氯酸钠 + 升汞10min），封闭式振摇灭菌。无菌水冲洗5 次，置于超净工作台上备用。接种前，剥去外部叶片，露出生长点，立即切取茎尖进行接种。 培养方法及培养条件试验于2006 年10 月在深圳市园林科学研究所组培室进行。诱导、增殖和生根培养基均选用MS为基本培养基，在不同培养阶段附加不同种类、不同浓度配比的植物生长调节剂（表2～表4），蔗糖3%，pH 。培养温度(28±2)℃，光照强度2 500 lx，光照周期为14h/d，相对湿度70%～80%。每处理接种30 瓶。定期观察试管苗生长与分化情况。2 结果与分析 不同消毒处理方式对外植体无菌化的影响因供试外植体取自美人蕉地下根茎，表面污染物较多，不易消毒，且不同植物及外植体的成熟度对消毒剂的反应不同，故本试验选用升汞和次氯酸钠进行灭菌效果比较，以筛选合适的消毒剂及消毒处理时间。由表1 可知，2%次氯酸钠20min 处理的无菌化效果较好，但茎尖褐化较严重，说明灭菌时间过长对去老皮后的幼嫩根茎影响较大。升汞10min 处理与2%次氯酸钠 + 升汞 10min处理，无菌化效果差异不大，但2%次氯酸钠 + 升汞 10min 处理有轻微药害。因此，后续实验选用升汞处理10min 进行外植体消毒。 不同生长调节剂配比对芽诱导的影响以MS 为基本培养基，附加不同浓度6-BA、NAA、2,4-D、KT、TDZ 等（表2），以筛选出较适宜美人蕉茎尖诱导分化的配方。因美人蕉根茎具有休眠特性，芽诱导分化较难。TDZ 具有很强的促进细胞分裂活性，～μmol/L 即可有效促进分化[4]，因此，本实验对TDZ 的诱导效果进行初步探索。试验表明，在不添加任何生长调节剂的MS 基本培养基（1 号）上，茎尖接种10d 后开始生长，叶片展开后，生长停止；15d 后转接到新的MS 培养基上无明显生长，随后叶片逐渐变黄、萎蔫，说明基本培养基中添加生长调节剂是美人蕉离体培养的必要条件。在仅添加6-BA 的2、3、4 号培养基中，高浓度的2 号培养基分化率为，明显好于3、4号培养基，说明美人蕉启动芽诱导分化需要高浓度的细胞分裂素（表2）。11～16 号培养基添加物为不同生长调节剂与TDZ 组合（表2）。仅添加TDZ 的培养基分化率为0，而多种生长调节剂配合使用分化效果更好[5]。其中15 号培养基的侧芽分化率最高，达，且每个茎尖可增殖2～3 个侧芽，但个别茎尖经多次转接后有畸形芽；与2 号培养基相比，分化率明显提高，说明添加低浓度TDZ 可促进芽诱导分化（表2）（图版-a）。5、6、7 号培养基为生根培养基，探讨NAA 对美人蕉茎尖生长和生根的影响。试验结果初步说明美人蕉在6-BA/NAA 小于2/ 时生根率可达50%以上（表2）。8、9、10 号培养基，探讨美人蕉脱分化，诱导愈伤组织，但结果均不理想。因此，建立高效的美表1 不同消毒剂及处理时间对外植体无菌化的影响处 理 接种数污染数污染率(%) 药害情况升汞10min 30 5 基本无药害2%次氯酸钠10min 30 12 无药害2%次氯酸钠20min 30 4 20%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞5min 30 10 3%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞10min 30 5 7%有药害第1 期 王丹,等：大花美人蕉茎尖组织培养技术研究 ·35·人蕉遗传转化再生体系还需进一步探索愈伤组织诱导途径。 芽继代增殖为了探讨优化的芽继代增殖培养基配方，按表3 设计6-BA、NAA、TDZ 的正交实验，以15 号培养基上分化出的丛生芽为接种材料，进行继代增殖培养（图版-b）。由表3 可见，除17、18 号培养基外，低浓度TDZ（）的分化促进作用较高浓度（）的效果好，说明高活性的TDZ 浓度过高反而抑制分化。当 时, NAA 促分化作用显著优于。在TDZ、NAA 浓度相同的情况下，随着6-BA 浓度的升高，分化率提高。但随着继代次数的增多，含高浓度6-BA的27 号培养基分化率略有下降，甚至有个别畸形芽产生，说明高浓度细胞分裂素对短期的分化有促进作用[9]，但继代数次后，芽已经萌动，自身具有分化能力，需适当降低6-BA 浓度进行壮苗，以避免畸形芽产生。因此，在增殖过程中交替使用分化增殖系数较高的19 号培养基和27 号培养基，既可保证较高的芽分化率，又可使继代苗生长健壮，减少畸形芽。 生根诱导增殖芽3～5cm 长时，转接到生根培养基上培养约10d 后，可见到根生成（图版-c）。接种20d 后统计生根结果（表4）。从表4可见，所用培养基上都有根生成，说明美人蕉生根较容易；结合生根率和生长势，我们认为MS + 6-BA + NAA 培养基较适宜美人蕉生根。表2 不同植物生长调节剂组合的比较植物生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA 2,4-D KT TDZ分化率(%) 生根率(%) 备注1 0 0 0 0 02 9 0 0 0 0 参考[2]3 5 0 0 0 0 参考[3]4 3 0 0 0 0 2 1 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0 08 0 0 4 0 09 0 0 2 1 0 参考[6]10 0 0 2 0 参考[7]11 0 0 0 0 012 0 0 0 参考[8]13 0 0 0 0 0 1 0 8 0 0 0 5 0 0 表3 不同生长调节剂配比对芽继代繁殖的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA TDZ接种数分化率(%)增值系数 生长势17 30 ++18 30 ++19 30 ++20 30 ++21 30 ++22 30 ++23 30 ++24 30 +25 30 ++26 30 +27 30 ++28 30 +注：++ 表示生长势强；+表示生长势弱。同列中不同字母表示差异显著(P＜＝，表4 同。表4 不同的生长调节剂配比对组培苗生根的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA接种数生根苗数生根率(%)植株生长势29 0 30 19 +30 0 30 21 ++31 30 20 +++32 30 16 ++注：+++ 表示生长势强；++表示生长势中等；+表示生长势弱。第·36· 37 卷3 结 论美人蕉根茎生长在土壤中，无菌化操作较困难。灭菌试验表明，升汞震荡灭菌10min 效果较好，采回的外植体应尽快处理接种，放置时间过长伤口处易染菌，导致接种后褐化较严重。MS + 6-BA + ZDT + NAA 培养基能较好地诱导分化丛生芽，MS + 6-BA + TDZ NAA 为较好的增殖培养基，在增殖培养过程中这两种配方交替使用效果更好；短时间使用高浓度生长调节剂对增殖有促进作用，但长时间使用高浓度生长调节剂会使组培苗质量下降。在试验中还发现，转接次数多的茎尖较转接次数少的分化率大，建议在接种后的10～20d 内及时转接。选用MS + 6-BA + NAA 为生根培养基，生根率较高，根系粗壮、根毛密集，植株生长健壮（图版-d），且移栽成活率较高。参考文献:[1] Segeren W, et al. The genus Canna in Northern South America[J]. Acta Bot Neerl., 1971,20(6): 663-680.[2] 刘文萍,等. 美人蕉茎尖组织培养及快繁技术[J]. 北方园艺, 2001(6): 32.[3] 丁爱萍,等. 美人蕉组织培养及快速繁殖技术[J]. 园林科技, 2006(1): 11-12.[4] Singh N D, et al. The effect of TDZ on organogenesis and somatic embryogenesis in pigeonpea (Cajanus cajan L. Millsp)[J].Plant Science, 2003,164(3): 341-347.[5] 王关林,等. 高活性细胞激动素TDZ 在植物组织培养中的应用[J]. 植物学通报, 1997,14(3): 47-53.[6] 宣朴,等. 生姜茎尖组培快繁技术研究[J]. 西南农业学报, 2004,17(4): 484-486.[7] Kromer K, et al. In vitro cultures of meristem tips of Canna indica L.[J]. Acta Horticulturace, 1985,167: 279-286.[8] Vendrame W A, et al. In vitro propagation and plantlet regeneration from Doritaenopsis Purple Gem 'Ching Hua' flowerexplants[J]. HortScience, 2007,42(5): 1 256-1 258.[9] 刘敏. 花卉组织培养与工厂化生产[M]. 北京: 地质出版社, 2002: 101-102.
★植物组织培养（PlantTissueCulture）：是指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。（主要有原生质体（Protoplast），悬浮细胞，组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织），器官（胚，花药，子房，根和茎）的培养。其中最常见的是愈伤组织培养。） ★愈伤组织（Callus）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 ★植物细胞全能性（Cellulartotipotency）：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。（Haberlandt,1902） ★微（快）繁步骤（micropropagation）： 母株（完整）→外植体（母株的一小部分，种子亦可）→接种到培养基上→长芽（继代增殖）→长根（试管外生根亦可）→练苗，驯化→完整植株 ★组培发展简史：细胞学说：Schleiden和Schwann。1.探索：20世纪初，Haberlandt提出“细胞全能性”（1902）；1904年，Hanning培养萝卜和辣根菜的胚成功；Laibach（1925,1929）亚麻种间杂种胚培养成功，证明胚培养在植物远缘杂交上可利用；1922年，Robiins（美）和Kotte（德）离体根尖培养成功。2.奠基：Gautheret，White和Nobecourt，组培奠基人。White和Gautheret发现了B族维生素和生长素；Skoog（1944）和Skoog和崔（1951）等发现腺嘌呤和生长素的比例控制芽和根的形成，Overbeek等（1941）首次将椰子汁（CM）作为添加剂，Steward等在胡萝卜组培也使用CM；1952年，Morel和Martin首次证实通过茎尖离体培养可获无病毒植株；1953-1954年，Muir单倍体培养获得成功；1955年，Miller分离出激动素（KT）；1957年，Skoog和Miller提出植物激素控制器官形成的概念；1958年，Steward首次证实Haberlandt的细胞全能性设想；Wickson和Thimann指出CTK打破腋芽休眠；Murashige发展快繁技术；1958-1959年，Reinert和Steward胡萝卜愈伤组培中形成体细胞胚。3.迅速发展：1971年，Takebe首次由烟草原生质体获得再生植株；1972年，Carlson获得烟草的第一个体细胞杂种；1964年，Guha和Maheshwari由毛曼佗罗离体花药培养胚；1960年，Morel提出离体无性繁殖兰花。……（具体seesee书本或课件） ★组培意义：1、基础理论研究（试验体系的准确性和可重复性，广泛用于细胞、组织的代谢生理及其它生化等方面的研究（如分化问题））。2、应用研究（无性繁殖系快速繁殖的生产、试管苗的商品化，遗传育种，种质保存，克服远缘杂交，种质资源创新，获得转基因植株）。 ★组培应用前景：1、作物育种上的应用（1、花药和花粉培养2、胚胎培养3、细胞融合4、基因工程5、培养细胞突变体6、种质保存）2、作物脱毒和快繁上的应用（马铃薯，兰花）3、在植物有用产物生产上的应用4、在遗传、生理、生化和病理研究上的应用。 ★植物激素调控：auxin/CTK>1(促进生根)；=1(愈伤组织)；<1(促进发芽) ★脱分化（dedifferentiation）：在组织培养中，不分裂的静止细胞，放在一定的培养基上后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。 ★再分化（redifferentiation）：一个成熟的植物细胞经历了脱分化后，能再分化而形成完整植株的过程。 ★再分化途径：1、器官发生方式（是指在外植体或愈伤组织的不同部位分别独立形成茎、芽和根，它们为单极性结构，各有维管束与外植体或愈伤组织相连，但在不定芽和不定根之间没有共同的维管束将两者连在一起。）2、胚胎发生方式（外植体直接或通过愈伤组织或悬浮培养产生胚状体。） ★胚状体（embryoid）：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构。其特点有：1、不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合产生。2、不同于孤雌/雄胚，因为它不是无融合生殖的产物。3、不同于器官发生方式形成的茎芽和根，因为它经历了与合子胚相似的发育过程且成熟的胚状体是双极性结构。 ★器官发生途径：1、茎尖或茎段培养产生腋芽。2、直接不定芽发生：器官的小块组织在培养基上培养直接诱导产生不定芽。3、间接不定芽发生：器官的小块组织在培养基上培养后先去分化形成愈伤组织，再经分化诱导产生不定芽或不定根。 ★胚胎发生方式：1、直接胚胎发生（从培养物中的器官组织，细胞或原生质体直接分化成胚，中间不经过愈伤组织）2、间接胚胎发生（外植体先愈伤化，然后由愈伤组织细胞分化成熟） 球型胚（globalembryo）→心型胚（heart-stageembryo）→鱼雷型胚（torpedo-stageembryo）→子叶型胚（cytoledon-stageembryo） ★人工种子：是指利用细胞的全能性将离体培养所产生的体细胞或具有发育成完整植株能力的分生组织（胚状体，茎和茎段）包裹在一层含有营养物质并具有保护功能的外膜内形成在适宜条件下能够发育成完整植株的小颗粒。 结构包括人工种皮，胚状体（分生组织），人工胚乳。 ★植物组织培养应用步骤：1、获得无菌外植体，建立起无菌培养体系。2、进行增殖，不断产生不定芽或胚状体。3、生根培养。4、试管苗移栽。 ★外植体选择的原则：1、必须含有活细胞。2、幼嫩组织所含活跃分裂的细胞比例高。3、母珠必须健康并且无任何腐烂或生病的迹象。4、母珠必须活跃生长并且不会立即进入休眠。 ★外植体的确定选择：1、茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限）；2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易）；3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）；4、花球和花蕾；5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。 ★消毒的原则：消毒剂与外植体应接触足够长的时间以除去外植体表面的微生物，但应尽量减少对外植体细胞的破坏。 ★消毒方法：冲洗植物材料除去泥土等大的颗粒→浸入70-75％乙醇，有利于植物表面的浸湿→用5-20％NaClO溶液（加1滴表面活性剂）表面消毒5-10min→用无菌水冲洗至少3遍→与消毒剂接触过的切面在转移到无菌培养基前应切去，因为消毒剂会杀死外露的细胞从而影响营养吸收→切取外植体，通常为10mm的茎段和直径10mm的叶片部分（太大激素作用减弱，太小则不易成活）。 ★消毒注意事项：1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。5、HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次。 ★茎尖培养：切取茎的先端部分或茎的分生组织部分进行无菌培养。 步骤：无菌培养的建立→芽的诱导→生根培养→试管苗的移栽（遗传变异） 注意点：试管苗移栽过程中，由异养→自养，恒温→温差，无菌→有菌，光弱→光强，湿度高→湿度低，应该保持苗的水分平衡（加塑料薄膜和使用喷雾机），选择适当的基质，注意光、温的条件。 ★安祖花：叶片→诱导愈伤组织→诱导芽→诱导根生根 ↓↑ 增殖→切根→芽的增殖→再培养→壮苗→生根之前 不定胚的诱导：组织片→含有2,4-D的培养基上→产生不定胚→去除2,4-D的培养基上→球型胚→心型胚→鱼雷型胚→植物体。 不定芽的诱导：用BA诱导，在球、心、鱼雷时要去除BA。 ★胚胎培养的意义：1、对于胚乳发育不良或胚与胚乳间不亲和的材料进行离体胚培养，有助于远缘杂交获得成功。2、为研究胚在各个发育时期的营养需要提供了一个很好的机会。3、能对整个胚及其各部分的再生潜力进行研究。 ★胚培养中的两个重要问题：1、胚剥离的方法：剥离的最佳时间是授粉后13-15天。2、培养基的成分：找到合适的培养基，在胚培养中加入蔗糖（能源、保持适当渗透压）。 ★花药培养方法： 取材地点：大田和温室 取材：大多采用单核期的花粉培养，因诱导产生愈伤组织或胚状体的频率较高。 花粉时期的确定：常采用醋酸洋红-碘化钾染色，再压片镜检。实际操作中常根据花蕾长度、大小与花粉年龄的相关性确定。 预处理：低温、高温或交叉处理 培养基：有MS，Nitsch，Miller，B5和N6。低浓度的生长素和细胞分裂素相结合，高浓度的蔗糖对花粉的诱导生长有一定作用。培养基中加入活性炭对提高诱导频率也有一定效果。 消毒、接种和培养：花药→在烧杯中研碎（有溶剂）→过滤→浓度梯度离心→收集中间层→离心 单倍体的鉴定和加倍处理：单倍体用2％秋水仙素处理24小时，愈伤组织细胞自然加倍。 ★花粉花药培养的意义：1、在单倍体细胞中只有一个染色体组，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。2、在品种间杂交育种过程中，通过F1代花药培养得到单倍体后，经染色体加倍立即成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代和常规育种相比，显著缩短了育种年限。 ★花药培养步骤（用改良的NLN培养基）： F1代花药→形成小孢子→分离小孢子→形成愈伤组织→形成胚→单倍体植株→纯合二倍体 ↓ 形成胚→单倍体植株→染色体加倍形成纯合二倍体 ★原生质分离：酶（纤维素酶，离析酶） 步骤：叶片表面消毒→去除表皮→叶碎片漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中→培育→原生质体沉到培养皿底部→除去酶溶液→将原生质体移入CPW清洗→离心→清洗基质两次→重悬浮于培养基→除去小的个体，用血球计计数→调整到合适的密度重悬浮于培养基。 ★原生质体的培养： 培养基：MS＋＋＋3％蔗糖＋9％甘露醇 注意：1、原生质体分离后，非常脆弱，需要渗透压保护剂的保护直到细胞壁形成。 2、针对不同的研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。 影响原生质体培养的因素：营养需求（NH4＋不能过多），渗压剂，培养密度（105/mL）， 贮藏条件（通常在黑暗处）。 培养方法：液体基质培养法，半液体基质培养法，固体基质培养法，看护培养。 固体培养的步骤：原生质体移入培养基→1体积含原生质体的培养基与1体积含琼脂糖（40℃）的培养基混和→倒转培养皿在25℃下培养→原生质体重新产生细胞壁并分裂成细 胞团→细胞团于琼脂糖基质中传代培养，培养基中应减少渗压剂以利于愈伤组织的形成→诱导分化成植物的根，茎。 ★原生质体分离培养的意义：1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。2、原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 ★原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。 ★体细胞杂交：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法称为体细胞杂交。 ★原生质体融合方法：自发融合，诱发融合（NaNO3处理，高PH-高浓度钙离子处理，PEG处理，电融合） PEG法： 取材（1、从绿色叶片上分离得到的原生质体。2、来源于同种或不同种的细胞悬浮培养物上分离出的无色原生质体）－这样异核体和母体就可分辨开。 →分别取在含有13％甘露醇的CPW上悬浮培养的原生质体（密度2×105）4mL，混和在100g的转速下离心10min，将原生质体放入％基质→加入30％（w/v）PEG2mL，使原生质体的外膜不稳定，放置10min→每隔5min加入原生质体培养基稀释PEG以促进原生质体融合。每次稀释后轻微摇动原生质体就会重悬浮→混和物在100g下离心10min，离心后在不含PEG的培养基中清洗→离心，在相同的培养基上重悬浮。 PEG法的缺点：有毒，融合率低：不超过1％ 对称融合：父母均未处理，对后代贡献一样。 不对称融合：父母本在后代中贡献不同，射线处理，化学处理 IOA（不影响核的分裂而影响细胞质分裂） ★胞质杂种：利用原生质体融合技术，使两种不同来源的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起，就形成胞质杂种。 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定方法：形态学，细胞学，分子遗传学。 ★园艺植物脱毒： 热处理脱毒： 原理：在高于正常温度下，植物组织中的很多病毒可被部分或完全钝化，而很 少伤害甚至不伤害寄主组织。 方法：热水处理（对休眠芽效果好），热空气处理（对活跃生长的茎尖效果好） 热空气处理方法：空气温度35-40℃，持续时间：随处理对象不同而变化，几分钟-几星期。 注意点：不能一下子放入高温中，要逐步加温使之适应。并保持湿度和光照。 局限性：1、并不是所有的病毒都对热处理敏感 2、对等径和线状的病毒及类菌质体引起的病害是有效的。 3、热处理后只有一小部分植株能够存活 ★茎尖分生组织：指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约100μm，最大长度为 250μm。 ★茎尖：由顶端分生组织及其下方的1-3个叶原基一起构成的。 ★茎尖培养脱毒： 原理：病毒在植物体内的分布是不均匀的，在受感染的植物中顶端分生组织通常不含或仅含低浓度的病毒，其它的植物组织离茎尖的距离越远则病毒含量越高。 影响茎尖培养脱毒效果的因素：培养基，外植体大小（脱毒效果跟外植体大小呈负相关，茎尖的成活率与茎尖大小呈正相关），贮存条件（光照培养优于暗培养），外植体的生理状态（活跃生长的芽，顶芽的效果比腋芽好，切割芽的时间） ★通过愈伤组织培养脱毒： 原理：在由受感染的组织形成的愈伤组织中，并非所有的细胞都均匀一致地带有该种病原体。 产生原因：1、病毒的复制速度跟不上细胞的增殖速度 2、有些细胞通过突变获得了抗病毒的特征。 ★脱毒植物的鉴定：外观判断法，指示植物法（接种鉴定法），抗血清鉴定法，电镜检查法， 分光光度法，酶联血清免疫吸附反应鉴定法。 指示植物法：利用病毒在其它植物上产生的枯斑作为鉴别病毒的标准。 指示植物：专门选用以产生局部病斑的寄主称为指示植物。 ★无毒原种的保存：种在温室或防虫罩内灭过菌的土壤中，隔离区内，通过组织培养繁殖。 组培常见英汉对照 abortion（败育）adenine（腺嘌呤）agar（琼脂）anther（花粉）apical（顶端的）aseptic(无菌的)auxin（生长素）axillarybud（腋芽）callus，calli（愈伤组织）cellulartotipotency（细胞全能性）cellulase（纤维素酶）cellulose（纤维素）centrifuge（离心）chloroplast（叶绿体）chromosomedoubling（染色体加倍）colony（细胞团，菌落）cybrid（cytoplasmichybrid,胞质杂种）cytokinin（细胞分裂素）cytoplasm（细胞质）degeneration（败育）dedifferentiation（脱分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（双子叶的）dihaploid（二单倍体）diploid（二倍体）dissect（剥离）dormancy（休眠）eliminate（除去）embryo（胚胎）embryoid（胚状体）embryogenesis（胚胎发生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant（外植体）filterpaper（滤纸）gelose（琼脂糖）genetype（基因型）germplasm（种质）globalembryo（球型胚）haploid（单倍体）heterokaryon（异核体）homozygous（纯合的）hormone（激素）interspecific（种间的）intraspecific（种内的）invitro（体外）invivo（活体）kinetin（激动素）macerozyme（离析酶）malesterile（雄性不育）medium（培养基）membrane（膜）meristem（分生组织）meristemculture（茎尖培养）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（单子叶植物）nodculture（茎段培养）organelle（细胞器）organgenesis（器官发生方式）osmotic（渗透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollenculture（花粉培养）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球茎protoplastfusion（原生质体融合）rapidpropagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility（自交不亲和）shoottip（茎尖）sodiumhypochlorite（NaClO）somaticembryo（体细胞胚）somatichybridization（体细胞杂交）somatichybrid（体细胞杂种）stem（茎）stemtipculture（茎尖培养）sterilant（消毒剂）steriledistilledwater（蒸馏水）sterilization（消毒）stockplant（母株）subculture(继代)sucrose（蔗糖）terminalbud（顶芽）transfer（转移）viruseradication（脱毒） 常用缩略语 ABA（脱落酸）CM（椰子汁）CPW（细胞-原生质体清洗液） DMSO（二甲基亚砜）IAA（吲哚乙酸）IBA（吲哚丁酸） KT（激动素）NAA（萘乙酸）PEG（聚乙二醇） LH（液氮）CH（水解酪蛋白）GA3（赤霉素）
植物细胞工程所谓细胞工程，是指以细胞为基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品。 细胞工程根据研究材料的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程，均主要由两部分构成。 其一是上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。 第二则是下游工程，是将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程。 其中细胞培养是细胞工程的技术基础。 顾名思义，植物细胞工程，是在细胞水平上针对植物细胞的细胞工程，它是细胞工程的一个重要组成部分。 自1904年Hanning成功培养离体胚以来，伴随着相关理论与技术的飞速发展，植物细胞工程也取得了巨大的成就。现在，我们已经可以利用细胞融合及DNA重组等现代生物技术从细胞和分子水平改良现有品种甚至于组建新品种。1983年转基因植物问世，并于1986年起被批准进入田间试验，美国APHIS到97年1月31日已批准多达两千五百八十四例田间试验。不仅如此，一些转基因植物已经开始进行商业化生产。从1994年Calgene公司的延熟番茄FLAVRSAVRTM成为首例被批准进行商业化生产的转基因作物开始，其后截止至1997年1月，美国已批准十七例，加拿大十八例，澳大利亚四例，日本七例。我国农业部也已于97年上半年批准了转基因延熟番茄的商业化。由此可见，植物细胞工程将对我们的生活产生越来越大的影响，我们应对此加以重视，了解一些新的研究成果及新技术，以求在生物工程这个二十一世纪的龙头产业中占有一席之地。 植物细胞工程涉及诸多理论原理及实际操作技术，首当其冲的自然是培养技术，也就是将植物的器官、组织、细胞甚至细胞器进行离体地、无菌的培养。它是对细胞进行遗传操作及细胞保藏的基础。此类技术发展起步较早，相对而言已比较成熟，各种培养基制备及很多操作方法已经基本规范化。针对植物的培养主要有植物组织培养、植物细胞培养、花药及花粉培养、离体胚培养以及原生质体培养这几个大类，每一种都还可可以继续细分为更具体的小类。组织培养首先将外植体分离出来，然后在无菌及适当条件下培养以诱导出愈伤组织，另外在愈伤组织随外植体生长一段时间后还需要进行继代培养，以避免代谢产物积累及水分散失等因素的影响。细胞培养可分为悬浮细胞培养、平板培养、饲养层培养和双层滤纸植板几类，它们都是将选定的植物细胞于适当的条件下进行培养，以得到大量基本同步化的细胞，为遗传操作提供材料。花粉及花药培养主要是使花粉改变正常发育途径而转向形成胚状体和愈伤组织，从而产生单倍体植株。离体胚培养有幼胚与成熟胚培养两类，通过使用相应的培养基使离体胚正常的萌发生殖，以供研究和操作使用。原生质体的培养则是一切利用原生质体进行遗传操作的基础，它是将取得的植物细胞去除细胞壁形成原生质体后进行培养，具体方法与细胞培养有一定的相似之处。作为后继操作的基础，培养技术的选择是非常重要的。采用适当的培养方法可以更好地进行遗传操作和保存细胞，而错误的选择是有可能影响结果甚至导致试验和生产失败，造成时间和金钱的浪费。 仅仅对细胞进行培养是不够，要使培养的细胞能为人类服务，就要对其进行一定的改造，这就涉及到了细胞的遗传操作。可以说，遗传操作是整个细胞工程中最为重要也最具挑战性的一环。它极大的依赖于理论原理、操作技术以及设备的发展。随着基因组学的发展，各项基因组计划正在紧锣密鼓地进行，由于DNA序列分析方法的革新，诸如高效毛细管自动化测序、DNA芯片法以及大规模平行实测法的应用大大加快了基因组计划的进程。拟南芥基因组计划将于2004年完成，水稻、番茄和玉米基因组的测序也正在进行。是类计划所提供的信息将不断定位大量有价值的基因，而最近的研究还表明影响作物产量的可以是单基因的改变而不仅仅是多基因决定。所有这一切的基础研究都为遗传操作提供了更多、更准确的理论依据。实验技术的发展则使精确、高效的遗传操作变得更加方便。将外源DNA导入靶细胞的方法不断完善，除了以前经常使用的质粒载体、病毒载体、转座因子和APC（酵母人工染色体）等途径外，通过lipoplex\polyplex介导、裸DNA、"基因枪"、超声波法和电注射法等非病毒方式转换细胞的方法也开始被广泛的使用；细胞融合方法已被不断的改进，融合率增大；细胞诱变也取得了较大的进展，诱变方式不断增加。这些理论和技术的发展都为更好的改造细胞创造了条件。 培养或改造好的细胞是进行研究和生产的基本材料，为了使其不致死亡并尽量保持优良的特性，就需要进行适当的保藏。一般是根据细胞的特点，人工创造条件使其生长代谢活动尽量降低，处于休眠状态，以抑制增殖和减少变异。作为世界上最大的细胞库，ATCC早在92年就已经有了三千两百多个细胞系入库，而且数量还在不断增加。此外还有CSH(美)、NCTC(英)、NRRL(英)、KCC(日)等著名的保藏机构，国内也有一些较为大型的机构，足见各国对细胞保藏的重视。由于植物细胞有其自身的特点，因而其保藏方法不可能与微生物完全相同。通常采用的方法是液氮超低温保藏方法。这种方法利用液氮的温度可以达到-196，远远低于一般细胞新陈代谢作用停止的温度（-130℃）从而使细胞的代谢活动停止，化学作用随之消失，达到长期保藏的目的。操作时要注意从常温到低温的过渡，以使细胞内的自由水通过膜渗出，避免其产生冰晶而损害细胞。另外还有低温冻藏法及其他一些保藏方法，但多用于短期保藏。 细胞工程的目的，是得到人们所需要的生物产品。要使已经改造好的细胞产生大量具有经济价值的产物，就必须依靠下游加工过程，也就是我们常说的下游工程。它的作用就是大量培养细胞，并从培养液中分离、精制出有关的生物化工产品。由于植物细胞的高度易碎性，对剪切力的敏感、细胞有去分化和聚集作用，增殖时间长等独特性，使其大规模培养技术明显比微生物和动物细胞的发展缓慢。但通过不懈的努力，现在已经具备在2万升规模的生物反应器中培养烟草细胞的能力。而日本的三井石化也已经在使用750L发酵罐通过培养植物细胞而生产紫草宁，且产量较高，可满足全日本百分之四十上的需要。相信随着理论以技术的不断完善，植物细胞的大规模的培养将会很快的成为一种常规的生产手段。培养后的培养物经过处理后被分离、提纯。分离和精制过程所需的费用在整个生产过程中的占有很大的比例，一般为60%，有些甚至高达80-90%，而且还有继续加剧的取向。因此该过程的落后也可能阻碍细胞工程的发展。世界各国现在已经都比较重视这个问题，英国早在83年就发起了生物分离计划(BIOSEP)，专门研究分离与精制，我国也曾经召开过专门会议。分离与精制的困难是由于培养液自身的理化特性所决定，这就需要在上游工程时就考虑到这方面的问题，同时不断推出新的分离纯化技术及方法，从而简化过程、降低成本，这在实际生产中是很重要的。 诚然，细胞工程的伟大和神奇确实令人惊叹不已，但随着这一类技术的迅猛发展，基因产品的广泛应用，其安全性已引起了人们的广泛关注。虽然从本质上来讲，转基因植物和常规育成的品种是一样的，两者都是在原有品种的基础上对其一部分进行修饰，或增加新特性，和消除原来的不利性状，但是，以前所用的有性杂交仅仅局限于种类和近缘种之间，而转基因植物却大胆突破了这一局限，其外源基因可以来自植物、微生物甚至动物。在这种情况下，人们对可能出现的新组合、新性状是否会影响人类健康和生物环境还缺乏足够的认识和经验。至少从目前来说，我们还不可能很精确的预测某一个外源基因在新的遗传背景中会产生什么样的相互作用。并且，转基因植物还可以对它所在的环境产生一定的影响。比如现在应用最多的抗除草剂基因就可能通过同属野生植物异花传粉而逐渐扩散进入自然界，从而使杂草的控制变得更加困难；而抗虫、抗病基因也有可能通过类似的途径转移到环境，给野生种群带来选择优势而变得无法收拾。虽然现在一般通过生殖隔离（设置缓冲作物带和隔离区）来防止基因漂流至临近作物，但若进行大规模生产和推广时就会难于加以控制。另外，转基因作物还可能造成对微生物的影响，Hoffman等就曾发现转基因油菜中的基因可转至黑曲霉中，虽然机制还不明确，但至少存在这个事实。自然界中存在着植物病毒间异源重组，病毒的异源包装（转移包装）可以改变其宿主范围。转基因植物表达的病毒外壳蛋白在体外实验中可以包装入侵的另一种病毒的核酸，产生一种新病毒，虽然在小规模的田间实验中并未发现这种情况，但长期的大规模生产应用中是否也是怎样呢？此外，公众对转基因植物的接受性和标签问题得到也是我们应该考虑的问题。 由此可见，细胞工程是一柄双刃剑，在造福于人类的同时也可能毁灭人类，甚至整个地球。这就要求我们在大力发展的同时注意其安全性，不断完善理论以技术，使其更好地为人类服务。 基因工程与它不一样！！！！植物体细胞杂交 植物体细胞杂交（Somatic hybridization）,又称原生质体融合（Protoplast fusion ）是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞具有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细胞融合也称为原生质体融合。 植物细胞杂交的几个重要进展 1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1970年，Power首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生质体诱导融合； 1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株； 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物细胞杂种； 1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术； 1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）； 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念； 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。 分类 根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类： 对称融合（asymmetric fusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。 非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，它可以分为几种： 用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类： 物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，它们能使细胞核失活； 化学处理目前常用的试剂有，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。 过程 将植物细胞A与植物细胞B用纤维素酶和果胶酶处理，得到不含细胞壁的原生质体A和原生质体B，运用物理方法或是化学方法诱导融合，形成杂种细胞，再利用植物细胞培养技术将杂种细胞培养成杂种植物体。 ①杂交时间：植物细胞杂交是从细胞融合开始，到培育成的新植物体结束。 a.原生质体制备：用酶解法去除细胞壁（纤维素酶和果胶酶） b.原生质体融合：膜融合（高钙、高pH诱导融合）、核融合（杂种细胞第一次有丝分裂时融合） 原生质体的融合 一、融合方法 1．PEG诱导融合法 PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较 高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。 PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极 性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在原生质体之间形成分子桥，其 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授 结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动 性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 融合技术要点： 融合液：CaCl2·2H2O 8~10mmol KH2PO4 甘露醇或山梨醇 pH 诱导液：融合液＋PEG 20～45％ 稀释液：A液（g/100ml） B液（g/100ml） 葡萄糖 甘氨酸 CaCl2·2H2O NaOH DMSO 10ml 2．电融合法 与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效 率高；三是融合技术操作简便。 电融合仪的结构特点：一是交变电场部分；一是高频直流电击部分。 电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生 质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体 紧密接触排列成串； P1 P2 P1 P2 混合静止1min. 融 合 融合液 加入PEG 稀 释洗 涤 加入稀释液 加入培养基 培 养 选 择 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而 导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的 处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。 影响原生质体融合的因素 首先，原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合 的首要条件。 其次，融合方法 其三是融合参数，包括各种融合液都应选择适当。 c.方法：物理方法（离心、振动、电激）、化学方法（聚乙二醇（PEG）） d.杂种细胞的筛选和培养：机械法、生理法、遗传法 e.杂种细胞的再生和鉴定：由愈伤组织再培养出杂种植株的过程 杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定 一、杂种细胞的发育动态 核质重组 细胞器重组 部分核物质或细胞器丢失 核分裂的非同步性 二、体细胞杂种的特点 形态上的趋中性 变异幅度大 非整倍性 双亲性状的共显性 偏亲现象 三、杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定 1．杂种细胞的选择系统 外观选择 互补选择 荧光标记选择 2．体细胞杂种的鉴定 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。 生化鉴定：同功酶鉴定。 分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。 体细胞杂种的遗传特性 1．细胞分裂与染色体丢失 如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂 几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。 如果这样就会产生几种情况：A细胞＋B细胞质；A细胞＋B细胞质和部分染色体或基因。 2．基因转移与性状表达 由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生 整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有 时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。 3．体细胞杂种遗传上的不稳定性 体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远 近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。 ②优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，扩大杂交亲本范围，培育新优良品种。 ③举例：“白菜-甘蓝”同白菜相比，具有生长期短，耐热性强，和易储藏等优点。 应用 体细胞杂种的应用 一、体细胞杂种的应用潜力 1、 植物育种中的核质替换 2、 细胞质杂种的获得 3、 远缘杂交创造新物种 4、 细胞器的互作研究 体细胞杂交面临的困难1、 融合特性的高效性 2、 杂种细胞的培养和选择3、 杂种的遗传稳定性控制 体细胞杂交研究的发展趋势 1、 诱导融合及杂种细胞的各种生理、生化、遗传机理的研 究 2、 电融合的程序化控制研究 3、 各种类型原生质体（胞质体、核质体、细胞器）的制备技术研究 4、 杂种细胞培养技术的程序化研究
植物组织培养及其应用研究概况在世界各国科学家的不断努力下，近几十年来，植物组织培养技术迅速发展。利用组织培养，不仅可以大量生产优良无性系，获得人类需要的多种代谢物质，还可获得单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体。通过细胞融合可以打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲合性，在植物新品种的培育和种性的改良中发挥了巨大作用。组织培养的植物细胞是在细胞水平上分析研究的理想材料，从植物快繁、花药培养发展到细胞器培养、原生质融合以及DNA重组技术等，植物组织培养技术广泛应用于植物科学的各个领域及农业、林业、工业、医药等多种行业，已经成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。1 植物组织培养的基本概念、原理和试验步骤1．1概念植物组织培养是在无菌条件下，将离体的植物器官(根尖、茎尖等)、组织(形成层、花药组织等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生质体等在人工配制的培养基上培养，给予适宜的培养条件，诱发其产生愈伤组织或潜伏芽或长成完整的植株的技术。1．2原理 植物组织培养的依据是植物细胞的“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德国著名植物学家 G．Haberlandt根据细胞学理论提出了一个观点，“高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞，即植物体细胞，体细胞在适当的条件下具有不断分裂、繁殖并发育成完整植株的潜力”。1943年，美国人White在烟草愈伤组织中偶然发现形成一个芽，证实了G．Haberlandt的论点。 不同植物所需要的生长条件不同，所用的培养基也有所不同。较常用的基础培养基有MT、MS、 SH、N6、White等。在组织培养中，愈伤组织和胚状体能否形成是培育出新植株的关键。通过在基础培养基里添加一定浓度的外源激素，可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官，最终获得再生植株或次生物质。 用于植物组织培养的材料称为外植体，其主要形式有器官、胚胎、单细胞、原生质体等。根据外植体的不同，所需要的培养基种类、培养条件、外源激素的种类及比例等均不同。植物组织培养中，影响培养力的因素是多方面的，诱导愈伤组织成败的关键在于培养条件，植物激素是诱导愈伤组织和绿苗分化的关键因素。最常用的诱导愈伤组织的生长素是IAA、NAA和2，4一D，所需浓度为O．01～10 mg／L。最常用的细胞分裂素是KT和ABA，使用浓度为O．1～10 mg／L。KT的主要作用是促进细胞分裂和愈伤组织分化。ABA对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。各类植物激素的生理作用虽有相对专一性，但是植物的各种生理效应是不同种类激素之间相互作用的综合表现。1．3试验步骤1．3．1选择和配制培养基 培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。1．3．2灭茵灭菌是组织培养中的重要工作之一，通常采用物理的或化学的灭菌方法。培养基用常压或高压蒸煮等湿热灭菌、器械采用灼烧灭菌、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌、不耐热的物质采用过滤灭菌、植物材料表面用消毒剂灭菌、物体表面用药剂喷雾灭菌、接种室等空间采用紫外线或熏蒸灭菌。1．3．3接种将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块放入培养基，整个接种过程要在无菌条件下进行。 ．4培养把培养材料放在有一定光照和温度等条件的培养室里，使之生长、分裂和分化，形成愈伤组织或进一步分化成再生植株。1．3．5试管苗驯化移栽 试管苗是在特殊环境条件下生长的幼苗，与自然生长的幼苗有很大差异，只有通过驯化，使之适应自然环境后才能移栽。2 植物组织培养的应用2．1植物快速繁殖和无病毒种苗生产植物快速繁殖技术始于20世纪60年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功，从此揭开了植物快速繁殖技术研究和应用的序幕。目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有100多科1 000种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界上80％～85％的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。培养的植物种类也由观赏植物逐渐发展到园艺植物、大田作物、经济植物和药用植物等。在我国，同类的研究始于20世纪70年代。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植，30余种植物已进行规模化生产或中间试验。利用组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。2．2植物花药培养和单倍体育种 将植物花药培养成单倍体植株，再经过染色体加倍，能很快得到纯合的二倍体，这样将大大缩短育种年限。到目前为止，世界上通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。印度科学家应用这种方法培育的水稻品系，比对照产量提高15％～49％。韩国先后育成了5个优质、抗病、抗倒伏的水稻品种。我国自20世纪70年代开始该领域的研究，已经培育了40余种由花粉或花药发育成的单倍体植株，其中有10余种为我国首创。玉米获得了100多个纯合的自交系；橡胶获得了二倍体和三倍体植株。仅“九五”期间就育成高产、优质、抗逆、抗病的农作物新品种44个，种植面积超过660万 hm2。2．3植物胚胎培养杂交育种中，杂种胚常常败育，因此将早期生长的胚取出，应用组织培养方法，就有可能培育出杂交植物。已经有100篇以上幼胚培养成为植株的报道。国内外科学家应用植物胚胎培养技术获得了多种远缘杂交的重组体、栽培种和杂交品种。2．4植物愈伤组织或细胞悬浮培养利用植物愈伤组织或细胞悬浮培养可以生产用于预防和治疗疾病的植物次生代谢产物。近年来，这一领域的发展极为迅速，已经研究了400多种植物，从培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于原植物，20种以上干重超过原植物的1 9，6。例如，从薯芋愈伤组织和悬浮细胞生产的diosgenin用于合成甾体药物。最近抗癌药物紫杉醇一红豆杉细胞培养物，可用75t发酵罐培养，已达到商业化生产水平。另外，达到商品化水平的还有紫草、人参、黄连、老鹳草等；长春花、毛地黄、烟草等已实现工业化生产；牙签草、红花等20多种植物正在向商品化过渡。2．5细胞融合与原生质体培养自1960年英国学者Cocking首次利用纤维素酶从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功以来，到1990年已有100种以上植物的原生质体能再生植株。我国获得了30余个品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物，如大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、棉花等。在木本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。国外已先后获得了种内及种间的体细胞杂种植株。植物原生质体培养还可应用于外源基因转移、无性系变异及突变体筛选等研究，因而越来越受到人们的重视。2．6植物细胞突变体筛选植物细胞突变体的筛选最早始于1959年，G． Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。1970年，P．S．Carlson，H．Binding和Y．M． Heimer等分别分离出烟草营养缺陷型细胞、矮牵牛抗链霉素细胞系及烟草抗苏氨酸细胞系。迄今为止，已经在不少于15个科45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的植物细胞突变体或变异体。其中包括抗病细胞突变体，如玉米抗小斑病突变体和小麦抗赤霉病、根腐病突变体；抗氨基酸及其类似物细胞突变体，如甘蓝型油菜抗HYP突变体[263；抗逆境胁迫细胞突变体，如水稻耐盐突变体和小麦抗盐突变体；抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体，如玉米抗除草剂变异体；株高突变体的筛选，如水稻矮秆变异体。2．7植物体细胞胚胎和人工种子1958年，Reinert在胡萝卜的组织培养中最先发现了体细胞胚胎(胚状体)。据不完全统计，能大量产生胚状体的植物有43科92属100多种。一些重要作物如水稻、小麦、玉米、珍珠谷等，也能通过离体培养产生胚状体。这些胚状体用褐藻酸钠等包埋，再加上人工种皮，就形成了人工种子。人工种子的优点是：繁殖快速，成苗率极高；不受气候影响，四季皆可工厂化生产。上世纪80年代初，美、日、法等国家相继开展了人工种子的研究，我国也于“七五”期间开展了此项研究，并于1987年列入了国家“863”高技术研究发展计划。2．8 植物组织细胞培养物的超低温保存与种质库建立植物细胞全能性的发现和证实，为植物种质资源的长期保存开辟了一条新途径。采用液氮超低温保存技术，能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如建立茎尖分生组织培养物的超低温保存种质库，不仅可以防止种质的遗传变异和退化，而且可以长期保存无病毒的原种。2．9 植物组织培养与转基因技术的应用 我国第一个T—DNA插入突变体库的构建和研究为我国水稻功能基因组学研究奠定了良好的技术和材料基础，为确保我国拥有一批有自主知识产权的基因资源做出了积极贡献。由中国水稻研究所农业部水稻生物学重点开放实验室和中科院上海植物生理研究所合作，通过建立大规模、高效的农杆菌介导的转基因技术体系，将玉米转座子Ac—Ds等外源基因导入水稻未成熟胚和种子诱导的愈伤组织，获得了1．2万个独立的T—DNA插入株系，并构建了水稻突变体的数据库。 3 展望植物组织培养研究与应用是20世纪科技进步的重大成果之一，为研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官发生与胚胎发生等提供了许多良好的实验材料和有效途径。植物组织培养方法不断提高的同时，也相应拓宽了其应用范围。由于组织培养在人工控制的条件下进行，容易掌握花芽分化和开花成因；通过胚胎培养，能够得到杂种或自交种；通过分离单倍体细胞，能培育纯合的二倍体优良品系；提高育种多样性的同时缩短了育种时间；通过突变体筛选，提高植物的品质，增强抗逆境胁迫能力，扩大植物的生长范围；将体细胞冷藏在低温下，建立基因库，达到保存物种的目的；获得药用价值高和工业生产所需要的次生产物，加快药物生产的时间并且减少了单纯依靠天然植物的被动性。植物组织培养技术已经渗透到科研、生产和生活各个领域，必将日臻完善。黑龙江农业科学2006，(3)
收稿日期：2007-10-25基金项目：深圳市科技和信息局基金资助项目作者简介：王丹（1982-），女，辽宁本溪人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。注：雷江丽为通讯作者。大花美人蕉茎尖组织培养技术研究王 丹1,2，雷江丽2，吴燕民3，吕 慧2，郁继华1(1.甘肃农业大学 农学院，甘肃 兰州 730070；2.深圳市园林科学研究所，广东 深圳 518003；3.中国农业科学院 生物技术研究所，北京 100081)摘 要：以大花美人蕉（Canna×generalis）根茎茎尖为外植体进行组织培养技术研究，筛选出芽诱导适宜的培养基为MS + 6-BA （单位下同）+ TDZ ；MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基能较好地诱导分化出丛生芽, 继代增殖培养中与MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基交替使用可减少畸形芽，增殖系数达；适宜的生根培养基为MS + 6-BA + NAA ，生根率达，且植株生长健壮，移栽易成活。关键词：大花美人蕉；茎尖；组织培养中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2008)01-0033-04Research on Shoot-tip Culture of Canna×generalisWANG Dan1,2, LEI Jiang-li2, WU Yan-min3, LÜ Hui2, YU Ji-hua1( of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu China; Institute of LandscapeGardening, Shenzhen 518003, Guangdong China; Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Beijing 100081, China)Abstract: The paper mainly studied on tissue culture of Canna×generalis with the stem tips asexplants. The results showed that the bud inoculation medium was MS + 6-BA ; the best of clump shoot induction and differentiation medium was MS + 6-BA +TDZ + NAA ; using MS + 6-BA + TDZ + NAA asproliferation medium, an optimal proliferation rate was obtained. When the two kinds of mediumused alternatively, the effect was better. The optimum rooting medium was MS + 6-BA +NAA , the rate of rooting could reach , and cultured in this medium, the plant grewwell and easy to words: Canna×generalis; shoot-tip; tissue culture大花美人蕉(Canna×generalis)属美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的园艺杂交种[1]，是多年生喜光宿根草本花卉，原产美洲热带和非洲等地。其枝叶茂盛、花朵艳丽、姿态优美、花期长，在深圳地区几乎全年开花，是配置大型花坛的优良品种。大花美人蕉不仅观赏价值高，而且能吸收硫、氯、氟、汞等有害物质，具有净化空气、保护环境的作用，因此，世界许多城市的园林绿化中都广泛应用。美人蕉传统的繁殖方式主要采用分切地下根茎的方法，繁殖速度慢、增殖效率低，而且连续营养繁殖造成病毒积累致使病毒病在各地相当普遍，严重影响其观赏价值。利用茎尖组织培养进行脱毒试管苗快繁，是目前大力繁殖与推广美人蕉的主要手段。关于美人蕉组织培养的研究报道较少[2,3]，本研究探索其组织培养高效的再生体系，以期为品种提纯复壮及遗传转化、性状改良奠定基础。2008,37(1): Plant Science第·34· 37 卷1 材料与方法 材料供试材料为目前城市绿化中普遍应用的大花美人蕉‘President’品种。 外植体选择与处理选择生长健壮、无病虫害的优良母株，挖取带芽胞的根茎，去除表面老皮并用肥皂水清洗。用75%乙醇棉擦拭，然后采用不同的消毒剂及处理时间（升汞10min、2%次氯酸钠10min、2%次氯酸钠20min、2%次氯酸钠 + 升汞5min、2%次氯酸钠 + 升汞10min），封闭式振摇灭菌。无菌水冲洗5 次，置于超净工作台上备用。接种前，剥去外部叶片，露出生长点，立即切取茎尖进行接种。 培养方法及培养条件试验于2006 年10 月在深圳市园林科学研究所组培室进行。诱导、增殖和生根培养基均选用MS为基本培养基，在不同培养阶段附加不同种类、不同浓度配比的植物生长调节剂（表2～表4），蔗糖3%，pH 。培养温度(28±2)℃，光照强度2 500 lx，光照周期为14h/d，相对湿度70%～80%。每处理接种30 瓶。定期观察试管苗生长与分化情况。2 结果与分析 不同消毒处理方式对外植体无菌化的影响因供试外植体取自美人蕉地下根茎，表面污染物较多，不易消毒，且不同植物及外植体的成熟度对消毒剂的反应不同，故本试验选用升汞和次氯酸钠进行灭菌效果比较，以筛选合适的消毒剂及消毒处理时间。由表1 可知，2%次氯酸钠20min 处理的无菌化效果较好，但茎尖褐化较严重，说明灭菌时间过长对去老皮后的幼嫩根茎影响较大。升汞10min 处理与2%次氯酸钠 + 升汞 10min处理，无菌化效果差异不大，但2%次氯酸钠 + 升汞 10min 处理有轻微药害。因此，后续实验选用升汞处理10min 进行外植体消毒。 不同生长调节剂配比对芽诱导的影响以MS 为基本培养基，附加不同浓度6-BA、NAA、2,4-D、KT、TDZ 等（表2），以筛选出较适宜美人蕉茎尖诱导分化的配方。因美人蕉根茎具有休眠特性，芽诱导分化较难。TDZ 具有很强的促进细胞分裂活性，～μmol/L 即可有效促进分化[4]，因此，本实验对TDZ 的诱导效果进行初步探索。试验表明，在不添加任何生长调节剂的MS 基本培养基（1 号）上，茎尖接种10d 后开始生长，叶片展开后，生长停止；15d 后转接到新的MS 培养基上无明显生长，随后叶片逐渐变黄、萎蔫，说明基本培养基中添加生长调节剂是美人蕉离体培养的必要条件。在仅添加6-BA 的2、3、4 号培养基中，高浓度的2 号培养基分化率为，明显好于3、4号培养基，说明美人蕉启动芽诱导分化需要高浓度的细胞分裂素（表2）。11～16 号培养基添加物为不同生长调节剂与TDZ 组合（表2）。仅添加TDZ 的培养基分化率为0，而多种生长调节剂配合使用分化效果更好[5]。其中15 号培养基的侧芽分化率最高，达，且每个茎尖可增殖2～3 个侧芽，但个别茎尖经多次转接后有畸形芽；与2 号培养基相比，分化率明显提高，说明添加低浓度TDZ 可促进芽诱导分化（表2）（图版-a）。5、6、7 号培养基为生根培养基，探讨NAA 对美人蕉茎尖生长和生根的影响。试验结果初步说明美人蕉在6-BA/NAA 小于2/ 时生根率可达50%以上（表2）。8、9、10 号培养基，探讨美人蕉脱分化，诱导愈伤组织，但结果均不理想。因此，建立高效的美表1 不同消毒剂及处理时间对外植体无菌化的影响处 理 接种数污染数污染率(%) 药害情况升汞10min 30 5 基本无药害2%次氯酸钠10min 30 12 无药害2%次氯酸钠20min 30 4 20%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞5min 30 10 3%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞10min 30 5 7%有药害第1 期 王丹,等：大花美人蕉茎尖组织培养技术研究 ·35·人蕉遗传转化再生体系还需进一步探索愈伤组织诱导途径。 芽继代增殖为了探讨优化的芽继代增殖培养基配方，按表3 设计6-BA、NAA、TDZ 的正交实验，以15 号培养基上分化出的丛生芽为接种材料，进行继代增殖培养（图版-b）。由表3 可见，除17、18 号培养基外，低浓度TDZ（）的分化促进作用较高浓度（）的效果好，说明高活性的TDZ 浓度过高反而抑制分化。当 时, NAA 促分化作用显著优于。在TDZ、NAA 浓度相同的情况下，随着6-BA 浓度的升高，分化率提高。但随着继代次数的增多，含高浓度6-BA的27 号培养基分化率略有下降，甚至有个别畸形芽产生，说明高浓度细胞分裂素对短期的分化有促进作用[9]，但继代数次后，芽已经萌动，自身具有分化能力，需适当降低6-BA 浓度进行壮苗，以避免畸形芽产生。因此，在增殖过程中交替使用分化增殖系数较高的19 号培养基和27 号培养基，既可保证较高的芽分化率，又可使继代苗生长健壮，减少畸形芽。 生根诱导增殖芽3～5cm 长时，转接到生根培养基上培养约10d 后，可见到根生成（图版-c）。接种20d 后统计生根结果（表4）。从表4可见，所用培养基上都有根生成，说明美人蕉生根较容易；结合生根率和生长势，我们认为MS + 6-BA + NAA 培养基较适宜美人蕉生根。表2 不同植物生长调节剂组合的比较植物生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA 2,4-D KT TDZ分化率(%) 生根率(%) 备注1 0 0 0 0 02 9 0 0 0 0 参考[2]3 5 0 0 0 0 参考[3]4 3 0 0 0 0 2 1 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0 08 0 0 4 0 09 0 0 2 1 0 参考[6]10 0 0 2 0 参考[7]11 0 0 0 0 012 0 0 0 参考[8]13 0 0 0 0 0 1 0 8 0 0 0 5 0 0 表3 不同生长调节剂配比对芽继代繁殖的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA TDZ接种数分化率(%)增值系数 生长势17 30 ++18 30 ++19 30 ++20 30 ++21 30 ++22 30 ++23 30 ++24 30 +25 30 ++26 30 +27 30 ++28 30 +注：++ 表示生长势强；+表示生长势弱。同列中不同字母表示差异显著(P＜＝，表4 同。表4 不同的生长调节剂配比对组培苗生根的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA接种数生根苗数生根率(%)植株生长势29 0 30 19 +30 0 30 21 ++31 30 20 +++32 30 16 ++注：+++ 表示生长势强；++表示生长势中等；+表示生长势弱。第·36· 37 卷3 结 论美人蕉根茎生长在土壤中，无菌化操作较困难。灭菌试验表明，升汞震荡灭菌10min 效果较好，采回的外植体应尽快处理接种，放置时间过长伤口处易染菌，导致接种后褐化较严重。MS + 6-BA + ZDT + NAA 培养基能较好地诱导分化丛生芽，MS + 6-BA + TDZ NAA 为较好的增殖培养基，在增殖培养过程中这两种配方交替使用效果更好；短时间使用高浓度生长调节剂对增殖有促进作用，但长时间使用高浓度生长调节剂会使组培苗质量下降。在试验中还发现，转接次数多的茎尖较转接次数少的分化率大，建议在接种后的10～20d 内及时转接。选用MS + 6-BA + NAA 为生根培养基，生根率较高，根系粗壮、根毛密集，植株生长健壮（图版-d），且移栽成活率较高。参考文献:[1] Segeren W, et al. The genus Canna in Northern South America[J]. Acta Bot Neerl., 1971,20(6): 663-680.[2] 刘文萍,等. 美人蕉茎尖组织培养及快繁技术[J]. 北方园艺, 2001(6): 32.[3] 丁爱萍,等. 美人蕉组织培养及快速繁殖技术[J]. 园林科技, 2006(1): 11-12.[4] Singh N D, et al. The effect of TDZ on organogenesis and somatic embryogenesis in pigeonpea (Cajanus cajan L. Millsp)[J].Plant Science, 2003,164(3): 341-347.[5] 王关林,等. 高活性细胞激动素TDZ 在植物组织培养中的应用[J]. 植物学通报, 1997,14(3): 47-53.[6] 宣朴,等. 生姜茎尖组培快繁技术研究[J]. 西南农业学报, 2004,17(4): 484-486.[7] Kromer K, et al. In vitro cultures of meristem tips of Canna indica L.[J]. Acta Horticulturace, 1985,167: 279-286.[8] Vendrame W A, et al. In vitro propagation and plantlet regeneration from Doritaenopsis Purple Gem 'Ching Hua' flowerexplants[J]. HortScience, 2007,42(5): 1 256-1 258.[9] 刘敏. 花卉组织培养与工厂化生产[M]. 北京: 地质出版社, 2002: 101-102.
从成本来说，水仙吧
我也是在百度知道里发现的，所以就复制过来给你看看，是不是你要的！看样子它有别名（人参榕）亚热带植物,由细叶榕（F icus microcarpa）的实生苗培育而成。根部就象人参一样，造型美观，姿态优美，种植时把它的根部露出泥面非常好看, 还可以用来嫁接不同品种的榕树。净化空气，寿命长（榕树万古长青，一年四季都可以生长，可种上数百年），四季常绿，生长快，好气性、易生根，抗性强，易造型，块根丰满，感观好，枝干光洁秀丽清雅，又利于塑造、能小中见大，耐寒耐旱，生命力强，养护管理简单,是居室内外摆设装饰的一道亮丽风景！适宜温度10—25,每10天左右浇透水一次，它基部膨大的块根，实际上是其种子发芽时的胚根和下胚轴发生变异突变而形成的。有的植株还在其干基部嫁接了金钱榕（）或卵叶榕（细叶榕的一个变种），显得更为高雅。它对光、热、水、肥的要求同一般的细叶榕，性喜温暖湿润和阳光充足的环境，不耐寒，耐半阴，生长适温为2 0℃至30℃，冬季棚室温度应维持不低于5℃。栽培土壤要求为疏松肥沃、排水良好、富含有机质、呈酸性反应的沙质壤土，碱性土易导致其叶片黄化、生长不良。生长期间，要求水分供应充足，宜湿不宜干，始终保持盆土湿润，夏季还应经常给叶面喷水。每年施肥次3次至4次，不能过量，否则易导致其枝叶徒长，破坏植株的构图造型。在其抽枝发叶期间，要适当控制浇水，或多喷水少浇水，可促成其节短叶厚，同时给予充足的光照，使其叶质厚实而又叶色光亮。应注意生长期间盆土也不能过湿，更不能光照不足，否则会引起大量落叶，影响到陈列观赏。其叶片往往易感染叶斑病，可用70％的甲基托布津可湿性粉剂800倍液喷洒，少量病叶也可及早摘除销毁，以防其蔓延为害。人参榕盆景，可每2年换盆一次，时间以春季出房前为最佳。先将花盆四周的土挑开，再轻轻取出硕大的块根植株，捣去一部分宿土，剪去一些无生命力的老化根系，重新选用新鲜肥沃、疏松排水、营养丰富的培养土栽好。随着植株的长大，可换更大一点的花盆，以满足其正常生长的需要。在换盆的同时，对枝叶作适度修剪调整，使其能继续保持良好的株形。刚换土时浇水不宜过多，待气温上升到20℃以上，再给予正常的水肥管理。榕树盆景的养护光照榕树耐半荫，更喜潮湿和阳光充足的环境。光照不足会影响生长而使树势变差，而且叶片稀薄无光泽，甚至枯黄脱落。故应将盆树置于光照充足的地方。土壤榕树适应性较强，喜酸性土，但在稍偏碱性土壤也能正常生长。以土壤较湿润为好，生长期间更应供给充足的水分，防止盆土过干或积水。湿度榕树为热带树种，喜湿热，炎热季节要经常向叶面或周围环境喷水以降温和增加空气湿度。肥水盆栽榕树主要是观叶，要经常追施氮肥并适当追施磷钾肥。在生长正常的情况下，控制氮肥的施用，并在其生长期间每半年追施一次液肥。人参榕浇水要见干见湿，盆土宜经常保持湿润，夏季要置于荫凉处，施肥依长势而定，一般生长旺季可每天隔1个月左右施一次充分腐熟的稀薄豆饼水、菜饼水、米糖水等。冬季要防止受冻，夏季要防止阳光暴晒，一年四季都要注意除虫灭病。人参榕---它的根部就象人参一样, 种植时把它的根部露出泥面非常好看, 还可以用来嫁接不同品种的榕树.它是祝寿的最佳礼品。榕苗培育园、榕瓜种植园，榕树盆景观赏园。捡籽、育苗、移植、嫁接一、播撒希望种子，培育优良榕苗到各棵古老的榕树下拾榕籽，经过晒干、刷选，然后翻土整地。播下种子。播种后，要进行浇水、遮阴、消毒。在幼苗长到高度10厘米时，把它移到塑料袋进行培育。在此期间，除了对榕苗进行施肥、浇水、喷药外，还要进行除草、刨根、松土，从而培育出优良的榕苗。二、移植优质榕瓜，为嫁接选好材在榕苗培育后，需要把优质的榕瓜移植到田地种一年的时间。在此期间．要进行除草、浇水、施肥、喷药、刨根等。三、实践嫁接、雕刻，创造劳动价值“查阅有关榕树嫁接、雕刻的书籍资料，在掌握了一定的嫁接、雕刻艺术后，便开始着手进行实践，经过剪技、嫁接、包扎、施肥、浇水等一系列程序，过二、三个月便可进行雕形。人参榕是由原生国内常见的榕树培育而成，约15-20公分，是小品盆景中之佼佼者。人参榕根部形似人参，形态自然、根盘显露、树冠秀茂、风韵独特，观姿赏形，令人妙趣横生，心情愉悦，深受世界各地消费者的喜欢，在荷兰已把其命名为“China roots”（中国根），是一个走向世界、具有中国品牌的花卉品种。人参榕品种规格繁多，大的有20多公斤，小的仅有50克，有嫁接泰国、印度细叶榕，广岛金钱榕等等。
细胞培养技术是细胞生物学研究的基础，在生物技术研究领域占有十分重要的位置。下面是我为大家整理的细胞培养论文，供大家参考。
细胞工程课程教学改革初探
细胞培养论文摘要
摘 要 细胞工程是我国本科院校生物技术专业的一门专业必修课。针对该课程特点，本文从优化理论教学和强化实践教学等方面进行了积极的探索，以便为细胞工程课程的教学改革提供参考。
细胞培养论文内容
关键词 生物技术 细胞工程 教学改革
中图分类号：G424 文献标识码：A
Discussion on Teaching Reform of Cell Engineering Course
LI Anzheng
(Teaching and Research Section of Biotechnology， Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430065)
Abstract Cell engineering is a professional required course for undergraduate biotechnology major of universities and colleges in china. In this paper， according to the characteristics of this course， positive exploration was carried on to optimize the theory teaching and strengthen the practice teaching， which may provide references to teaching reform of cell engineering course.
Key words biotechnology; cell engineering; teaching reform
21世纪是生命(生物)科学的世纪。生物技术是应用生命科学研究成果对生物或生物的成分进行改造和利用的综合性技术体系，包括细胞工程、基因工程、酶工程、发酵工程和生化工程五大技术范畴。其中细胞工程是应用运用生物学研究所积累的知识和技术，在细胞水平上开发利用生物材料或生物系统，并以一定的工艺获得产品(细胞系、细胞株，生物体或其次生代谢产物)的有关理论和技术的学科。
我校生物技术专业于2005年开始招生，经8年的专业建设，目前已经形成较为完善的理论和实践教学体系。目前细胞工程已经成为高等院校生物技术专业的主干课程之一。学好这门课程， 将为学生今后从事生物学领域的相关研究及与细胞工程有关的生物技术产业工作莫定良好的理论和技术基础。贯彻“以学生为主体”的教学理念，提高教学质量、培养高素质应用型人才是包括我校在内的诸多院校孜孜追求的目标。结合细胞工程课程特点以及本校的实际情况，生物技术教研室对该课程教学内容、 教学 方法 、实验教学等进行了一系列的改革探索。
1 理论教学改革
优化教学内容
教学内容决定了学生的基本知识结构，影响学生基本能力的形成，教学内容是否充实与新颖，对教学质量的提高具有重大影响。鉴于精品课程是具有一流教师队伍、一流教学内容、一流教学方法、一流教材、一流教学管理等特点的示范性课程，在细胞工程这门课程的教学中，结合中医药院校的中医药特色以及生物技术教研室教师队伍的实际，我们引进了由“211”高校华中农业大学创建的国家精品课程——细胞工程学的内容。
在教材的选用上，以高等 教育 出版社出版的柳俊教授主编的《植物细胞工程》作为教学参考书，该书系统地介绍了植物组织细胞培养技术，既说明了操作方法，也论述了其中的理论原理，比较适合于本科生的学习。同时，在教学中补充关于动物细胞工程的内容，并向学生推荐了一些参考书。
同时完善教学大纲，对教学内容作适当增减。细胞工程与其他生物科学密切相关， 如作为先修课程的植物生物学、动物生物学、细胞生物学和分子生物学等，因此在内容上有些章节会有重复，对此可以略讲或加以提问以示复习。如植物胚乳培养中涉及胚乳发育的三种途径(核型胚乳、细胞型胚乳和沼生目型胚乳)，该内容在植物生物学中已经学习，在此可略讲。
此外，进入新世纪后包括细胞工程在内的生物技术各领域的新成果日新月异，因此对教师而言，不仅要教授给学生这个领域的基本原理、基本方法和基本技术，而且也要把最新研究进展融入到教学中来。这就要求教师必须能够随时关注该领域发展的最新动态(查阅国内外权威文献)，并及时把相关内容补充到教学内容中，从而激发学生学习的兴趣，增强学生学习的自觉性和创造性。要求认真细致地备好每每一节课(包括实验课)，并在课后进行教学 反思 ，所以尽管课程每年基本是重复的，但每年都有新的体会，需要花大量时间认真备课。
改革教学方法
激发学生的学习兴趣，发挥其主观能动性。所谓兴趣是最好的老师，带着兴趣学习，可以发挥学生的主观能动性，对教学效果的提高无疑是大有裨益的。大学传统的教学模式往往是灌输式的，老师是知识的传输者;新的教学模式比如启发式教学则要求老师由知识的传输者转变为学习的引导启发者，激发学生的学习兴趣，调动学生学习的主动性和积极性。因此在教学过程中，可以选择细胞工程的某一章节或者某一知识点的内容，尝试让学生体验课堂教学，以培养学生的独立思考能力、查阅文献能力、 总结 归纳能力及语言表达能力。
注重师生互动，积极引导学生学习。一般上新课之前会花几分钟时间复习旧课，即对上次课的内容提出几个问题，让学生思考回答。这样既可以巩固已学内容，又可以衔接新课内容，可谓承上启下，一举两得。另外在授课过程中也需要观察同学们对某一知识点的掌握情况，尤其是涉及一些先修课程的内容，也会随时提问并做解答。所有的提问，要兼顾到每一位同学，即每一个同学都有回答问题的机会;对回答得好的同学要大力表扬，对回答不上来的同学也要加以鼓励。 认真制作多媒体课件，优化多媒体教学。随着社会经济水平的提高和科技水平的进步，充分利用多媒体等现代教学手段也是对专任教师的必然要求。目前我校绝大多数教室都配备了多媒体教学系统，细胞工程这门课程也采用了多媒体授课。如何将传统板书教学的提纲挈领与多媒体教学的大信息量实现有机结合，是教学过程中需要用心思考的问题。在多媒体课件(PPT幻灯片)的制作过程中，坚持“文字少而不缺，图表多而不杂”的原则，将传统的板书的要点集中体现在其中某一张幻灯片上，然后添加一些超级链接用图表对每一要点作详细说明，做到既要发挥多媒体教学的优势，又不失传统教学的效果。同时还可以在多媒体课件上完善外文(英语)专业词汇，增加学生 专业英语 的基础。
2 实践教学改革
细胞工程是一门实践性很强的学科。在实验内容的设置上，本着整合教学资源，优化教学内容的原则，在我校生物技术专业培养方案中将包括细胞工程在内的数门专业课的实验加以整合，开设了生物技术综合实验。其中有对应的细胞工程部分以动物细胞培养和植物组织培养过程为基本内容。在实验过程中前一个实验为后一个实验做准备，后一个实验是前一个实验的深入。实验过程从培养基的制备到材料的消毒灭菌接种，到实验结果的观察，学生需要全程参与。考虑到因为污染等原因导致某一次实验失败而导致后续实验无法开展的问题，在实验过程中指导老师要随时关注培养情况并采取预防 措施 ，比如多准备一些实验材料;或者指导老师除演示实验过程外，每次也作为其中的实验小组参与实验。实验 报告 的书写上要求同学们如实报告实验结果，即使是失败的结果也要求写上并分析原因。
3 结语
课程教学是实现教育培养目标的重要手段。在细胞工程课程教学过程中， 我们优化教学内容，引入了“211”高校的精品课程并加以消化，把最新的科研成果融入到教学内容中;采用了灵活多样的教学方法和多媒体教学手段，使教学质量得到了相应的提高。在今后的教学过程中将与时俱进，不断总结 经验 ，进一步完善教学内容、教学方法，尤其要加强细胞工程实验的开设，丰富实验内容，把细胞工程课程教学水平提高到一个新的层次。
细胞培养论文文献
[1] 柳俊，谢从华.植物细胞工程(第2版)[M].北京：高等教育出版社，2011.
[2] 姜振华，周大祥.地方本科院校细胞工程教学改革探索[J].教育教学论坛，2013(27)：52-53.
[3] 王义，刘思言，孙春玉等.在《植物细胞工程》课程教学中培养学生科研能力的思考与实践[J].中国校外教育(理论)，2008(9)：85-86.
[4] 杨清玲，章尧，陈昌杰等.生物技术综合实验建设的研究[J].蚌埠医学院学报，2009(34)：166-168.
细胞工程教学改革与探索
细胞培养论文摘要
摘要根据细胞工程教学实际,从师资队伍、教学内容、教学方法及考核方式等方面进行探讨,以为细胞工程教学改革提供新思路。
细胞培养论文内容
关键词细胞工程;教学改革;考核方式
细胞工程是理论与实践结合的综合性很高的一门学科,是应用细胞生物学和分子生物学的原理方法,在细胞水平上研究、改造生命遗传物质,以获得具有目的性状的细胞系或生物体的理论和技术的学科,它既是现代生物技术的重要组成部分,也是现代生物学研究的重要技术工具,在高校生命科学及相关学科的课程设置中占有重要地位[1-2]。学好这门课程,将为学生今后从事生物学领域的相关研究及与细胞工程有关的生物技术产业工作奠定良好的理论和技术基础。授课教师必须充分发挥自身专业优势,适应学科发展需要,积极引导学生科学认知并对该领域产生兴趣,系统把握相关原理、方法、技术和进展;同时培养学生综合能力,增强教学效果。在不断探索的过程中,结合细胞工程的特点,就提高细胞工程教学的质量进行探讨。
1加强师资队伍建设
组建教学团队
为了解决教学内容学科跨度大、背景不同的问题,打破传统的一人一课的教学模式,组建教学团队,将教学内容分为不同的教学模块。每一模块由具有相应专业背景的教师承担,力争紧跟各教学内容的学科前沿。
提高教师教学水平
为了提高教学水平,课题组成员定期进行现代教学思想和现代教学方法的学习与讨论;定期组织在教学方法上有建树的专家进行听课和有针对性的评课;督促教师认真备课,业务上要精益求精,特别要求教学内容要紧跟学科前沿,使自己成为本专业的真正专家和学者,站在本专业知识发展前沿。同时不定期展开自评和互评,以促进整体教学水平的提高。
2融合科技发展,改革、更新教学内容
细胞工程是一门涉及面较广的综合性学科,无论是教师的教,还是学生的学都具有一定的难度,这就要求在授课内容的选择上,即要注意内容的系统性与完整性,又要保证授课内容的全面、趣味、实用。结合生物技术专业的教学目的和现有教材,在课程内容上,主要围绕以下几个方面展开:一是细胞工程基础,包括基本概念,主要研究内容,细胞培养的基本设施、条件、方法和技术等;二是植物细胞工程,包括植物组织培养、脱毒与快繁、单倍体诱导与育种、胚胎培养、体细胞胚胎发生和人工种子技术、原生质体融合、染色体工程、转基因技术等;三是动物细胞工程,包括动物细胞培养、细胞融合、染色体工程、细胞重组与克隆、转基因动物与生物反应器等;四是细胞工程的实践与应用,包括细胞工程及其相关技术的发展现状与应用进展,及其产业化发展前景等。
此外,由于当今世界科学技术突飞猛进,知识信息量增长迅速,细胞工程的研究内容也日新月异,新技术、新方法不断涌现。这就要求任课教师在教学中要适时地调整并更新教学内容,站在现代科技发展的前沿,掌握生物工程领域科技发展的最新动态,及时把这些动态、研究成果以及有待攻关的重大课题融入教学内容,激发学生学习探索新知识的兴趣,提高学生的综合能力。如在讲解“克隆技术”时,及时把国内外最新的成果向学生传播,包括2007年12月14日韩国孔一根教授通过一只成年雌性土耳其安哥拉猫的表皮细胞克隆出3只含荧光蛋白的白色小猫;2009年1月Cloning and Stem Cells杂志网络版报道,山东省干细胞工程技术研究中心、烟台毓璜顶医院成功获得人体细胞克隆胚。又如在讲解“染色体工程”时,结合2009诺贝尔生理医学奖的最新成果进行阐述。
3改革教学方法
采用启发式、探究式教学方法
作为综合技术课程,细胞工程的各章节逻辑性不强,理论表述较少,应用技术细节较多,给欠缺基础知识的学生在理解、记忆课本内容时带来较大的难度。因此,在教学过程中,要大力提倡启发式、问题探究式、讨论式、训练与实践式教学方法,鼓励学生大胆质疑、自由探索,最大限度地发挥学生学习的主动性、积极性和创造性。例如在讲授细胞重组与克隆过程中,只讲解细胞重组和克隆相关原理,而克隆的最新进展则由学生在查阅资料后,对其做讲解和归纳总结,由教师和其他学生给予评价和修正。
应用 现代教学手段,提高教学质量
细胞工程是一个基础性和实践性很强的学科,课程的信息量大,内容基本是微观水平,传统的的教学模式无法为学生呈现如此大信息量的课程内容,而且也很容易引起学生对课程的懈怠,降低学习兴趣,影响教学效果。为了提高教学效果,以 计算机为工具,通过多媒体、教学录像、 网络资源、CAI课件等现代化教学手段,不仅可以向学生提供丰富多彩的教学信息,还可以提供更加美观的人机交互界面,充分调动学生的情绪、情感、注意力和兴趣[3]。这样就可以使那些抽象的、在普通条件下难以观察到的过程直观而形象地展示出来,有利于增长学生独立灵活地分析问题、解决问题的能力,提高教学质量,同时激发学生的学习兴趣。
开展各种教学活动
在正常的授课之余,还尝试打破常规的教学方式,开展丰富多彩的教学活动,对于培养学生学习兴趣、充分调动学生学习积极性有着很好的效果[4]。如在期中时,给学生布置写一篇综述的任务,题目和内容自定,只要是学生自己感兴趣、与本学科内容相关的即可。学生通过查找资料,对生物学科产生了浓厚的兴趣,甚至产生了以后从事这方面工作的愿望,有的还主动找到教师,申请提前进入实验室。又如在教学过程中,尝试让学生在学完每章内容后自己试编题并给出答案,然后以作业的形式上交,教师综合学生编写的题目和各方面资料建立题库。这种形式,一方面,体现尊重学生、信任学生的教学原则,同时极大地调动了学生学习细胞工程的积极性和主动性;另一方面,学生编题的过程也是学习掌握的过程,让学生的学习达到事半功倍的效果。
4改革考核方式
目前,大多大学生对期末 考试“一考定终身”不满,因此,制定 科学可行的考核办法对提高学生的学习积极性和改进教学效果都具有重要的作用。为了引导学生全面 发展,科学评价学生的学习情况,该课程针对目前考试中存在的问题,从以下几个方面进行了考试模式的改革探索:一是在考试内容上除了包括课程的基础理论、基本知识、基本技能等,同时也考察学生的在融会贯通基础上分析问题、解决问题的能力;二是加强平时成绩考核,将课堂的出勤、回答问题、作业、讨论及课堂讲述等情况记入平时成绩;三是最后总评分时按平时成绩占30%(作业、出勤、课堂的参与程度等),平时的课堂活动、创新活动占10%(包括撰写研究综述、运用细胞工程技术手段、设计方案解决实际问题、成立兴趣小组、参与课题研究、课堂讲课等),期末考试占60%(注重考查运用理论知识解决实际问题的能力)。
5结束语
在科技竞争、人才竞争、 经济和科学技术迅速发展的形势下,通过研究与探索细胞工程课程教学体系,把最新的科技发展成果融入到教学内容中,采用先进的教学内容和现代化的教学方法与手段,改革考核方式,细胞工程课程教学改革取得了一些成绩。今后,要不断通过学习掌握新的知识、提高自身的理论认知水平,同时每次上课前精心备课,并在教学实践中对课程教学体系不断改进,提高细胞工程的教学质量。
细胞培养论文文献
[1] __勇.细胞工程[M].北京:科学出版社,2003.
[2] 胡尚连,孙短,曹颖.植物细胞工程理论与实践教学体系探索与实践[J]. 中国校外 教育:理论,2008(2):136-137.
[3] 张一春.现代教育技术实用教程[M].南京:南京师范大学出版社,2005.
[4] 梁亦龙,魏进民,张继承.细胞工程教学改革的探索[J].实验室科学,2009(4):25-26.
有关细胞培养论文推荐：
1. 生物学论文范文
2. 生物技术论文范文
3. 生物制药技术论文范文
4. 生物工程论文范文
5. 高中生物小论文范文精选
6. 生物工程毕业论文范文
7. 医学科研课题开题报告范文
收稿日期：2007-10-25基金项目：深圳市科技和信息局基金资助项目作者简介：王丹（1982-），女，辽宁本溪人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。注：雷江丽为通讯作者。大花美人蕉茎尖组织培养技术研究王 丹1,2，雷江丽2，吴燕民3，吕 慧2，郁继华1(1.甘肃农业大学 农学院，甘肃 兰州 730070；2.深圳市园林科学研究所，广东 深圳 518003；3.中国农业科学院 生物技术研究所，北京 100081)摘 要：以大花美人蕉（Canna×generalis）根茎茎尖为外植体进行组织培养技术研究，筛选出芽诱导适宜的培养基为MS + 6-BA （单位下同）+ TDZ ；MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基能较好地诱导分化出丛生芽, 继代增殖培养中与MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基交替使用可减少畸形芽，增殖系数达；适宜的生根培养基为MS + 6-BA + NAA ，生根率达，且植株生长健壮，移栽易成活。关键词：大花美人蕉；茎尖；组织培养中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2008)01-0033-04Research on Shoot-tip Culture of Canna×generalisWANG Dan1,2, LEI Jiang-li2, WU Yan-min3, LÜ Hui2, YU Ji-hua1( of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu China; Institute of LandscapeGardening, Shenzhen 518003, Guangdong China; Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Beijing 100081, China)Abstract: The paper mainly studied on tissue culture of Canna×generalis with the stem tips asexplants. The results showed that the bud inoculation medium was MS + 6-BA ; the best of clump shoot induction and differentiation medium was MS + 6-BA +TDZ + NAA ; using MS + 6-BA + TDZ + NAA asproliferation medium, an optimal proliferation rate was obtained. When the two kinds of mediumused alternatively, the effect was better. The optimum rooting medium was MS + 6-BA +NAA , the rate of rooting could reach , and cultured in this medium, the plant grewwell and easy to words: Canna×generalis; shoot-tip; tissue culture大花美人蕉(Canna×generalis)属美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的园艺杂交种[1]，是多年生喜光宿根草本花卉，原产美洲热带和非洲等地。其枝叶茂盛、花朵艳丽、姿态优美、花期长，在深圳地区几乎全年开花，是配置大型花坛的优良品种。大花美人蕉不仅观赏价值高，而且能吸收硫、氯、氟、汞等有害物质，具有净化空气、保护环境的作用，因此，世界许多城市的园林绿化中都广泛应用。美人蕉传统的繁殖方式主要采用分切地下根茎的方法，繁殖速度慢、增殖效率低，而且连续营养繁殖造成病毒积累致使病毒病在各地相当普遍，严重影响其观赏价值。利用茎尖组织培养进行脱毒试管苗快繁，是目前大力繁殖与推广美人蕉的主要手段。关于美人蕉组织培养的研究报道较少[2,3]，本研究探索其组织培养高效的再生体系，以期为品种提纯复壮及遗传转化、性状改良奠定基础。2008,37(1): Plant Science第·34· 37 卷1 材料与方法 材料供试材料为目前城市绿化中普遍应用的大花美人蕉‘President’品种。 外植体选择与处理选择生长健壮、无病虫害的优良母株，挖取带芽胞的根茎，去除表面老皮并用肥皂水清洗。用75%乙醇棉擦拭，然后采用不同的消毒剂及处理时间（升汞10min、2%次氯酸钠10min、2%次氯酸钠20min、2%次氯酸钠 + 升汞5min、2%次氯酸钠 + 升汞10min），封闭式振摇灭菌。无菌水冲洗5 次，置于超净工作台上备用。接种前，剥去外部叶片，露出生长点，立即切取茎尖进行接种。 培养方法及培养条件试验于2006 年10 月在深圳市园林科学研究所组培室进行。诱导、增殖和生根培养基均选用MS为基本培养基，在不同培养阶段附加不同种类、不同浓度配比的植物生长调节剂（表2～表4），蔗糖3%，pH 。培养温度(28±2)℃，光照强度2 500 lx，光照周期为14h/d，相对湿度70%～80%。每处理接种30 瓶。定期观察试管苗生长与分化情况。2 结果与分析 不同消毒处理方式对外植体无菌化的影响因供试外植体取自美人蕉地下根茎，表面污染物较多，不易消毒，且不同植物及外植体的成熟度对消毒剂的反应不同，故本试验选用升汞和次氯酸钠进行灭菌效果比较，以筛选合适的消毒剂及消毒处理时间。由表1 可知，2%次氯酸钠20min 处理的无菌化效果较好，但茎尖褐化较严重，说明灭菌时间过长对去老皮后的幼嫩根茎影响较大。升汞10min 处理与2%次氯酸钠 + 升汞 10min处理，无菌化效果差异不大，但2%次氯酸钠 + 升汞 10min 处理有轻微药害。因此，后续实验选用升汞处理10min 进行外植体消毒。 不同生长调节剂配比对芽诱导的影响以MS 为基本培养基，附加不同浓度6-BA、NAA、2,4-D、KT、TDZ 等（表2），以筛选出较适宜美人蕉茎尖诱导分化的配方。因美人蕉根茎具有休眠特性，芽诱导分化较难。TDZ 具有很强的促进细胞分裂活性，～μmol/L 即可有效促进分化[4]，因此，本实验对TDZ 的诱导效果进行初步探索。试验表明，在不添加任何生长调节剂的MS 基本培养基（1 号）上，茎尖接种10d 后开始生长，叶片展开后，生长停止；15d 后转接到新的MS 培养基上无明显生长，随后叶片逐渐变黄、萎蔫，说明基本培养基中添加生长调节剂是美人蕉离体培养的必要条件。在仅添加6-BA 的2、3、4 号培养基中，高浓度的2 号培养基分化率为，明显好于3、4号培养基，说明美人蕉启动芽诱导分化需要高浓度的细胞分裂素（表2）。11～16 号培养基添加物为不同生长调节剂与TDZ 组合（表2）。仅添加TDZ 的培养基分化率为0，而多种生长调节剂配合使用分化效果更好[5]。其中15 号培养基的侧芽分化率最高，达，且每个茎尖可增殖2～3 个侧芽，但个别茎尖经多次转接后有畸形芽；与2 号培养基相比，分化率明显提高，说明添加低浓度TDZ 可促进芽诱导分化（表2）（图版-a）。5、6、7 号培养基为生根培养基，探讨NAA 对美人蕉茎尖生长和生根的影响。试验结果初步说明美人蕉在6-BA/NAA 小于2/ 时生根率可达50%以上（表2）。8、9、10 号培养基，探讨美人蕉脱分化，诱导愈伤组织，但结果均不理想。因此，建立高效的美表1 不同消毒剂及处理时间对外植体无菌化的影响处 理 接种数污染数污染率(%) 药害情况升汞10min 30 5 基本无药害2%次氯酸钠10min 30 12 无药害2%次氯酸钠20min 30 4 20%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞5min 30 10 3%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞10min 30 5 7%有药害第1 期 王丹,等：大花美人蕉茎尖组织培养技术研究 ·35·人蕉遗传转化再生体系还需进一步探索愈伤组织诱导途径。 芽继代增殖为了探讨优化的芽继代增殖培养基配方，按表3 设计6-BA、NAA、TDZ 的正交实验，以15 号培养基上分化出的丛生芽为接种材料，进行继代增殖培养（图版-b）。由表3 可见，除17、18 号培养基外，低浓度TDZ（）的分化促进作用较高浓度（）的效果好，说明高活性的TDZ 浓度过高反而抑制分化。当 时, NAA 促分化作用显著优于。在TDZ、NAA 浓度相同的情况下，随着6-BA 浓度的升高，分化率提高。但随着继代次数的增多，含高浓度6-BA的27 号培养基分化率略有下降，甚至有个别畸形芽产生，说明高浓度细胞分裂素对短期的分化有促进作用[9]，但继代数次后，芽已经萌动，自身具有分化能力，需适当降低6-BA 浓度进行壮苗，以避免畸形芽产生。因此，在增殖过程中交替使用分化增殖系数较高的19 号培养基和27 号培养基，既可保证较高的芽分化率，又可使继代苗生长健壮，减少畸形芽。 生根诱导增殖芽3～5cm 长时，转接到生根培养基上培养约10d 后，可见到根生成（图版-c）。接种20d 后统计生根结果（表4）。从表4可见，所用培养基上都有根生成，说明美人蕉生根较容易；结合生根率和生长势，我们认为MS + 6-BA + NAA 培养基较适宜美人蕉生根。表2 不同植物生长调节剂组合的比较植物生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA 2,4-D KT TDZ分化率(%) 生根率(%) 备注1 0 0 0 0 02 9 0 0 0 0 参考[2]3 5 0 0 0 0 参考[3]4 3 0 0 0 0 2 1 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0 08 0 0 4 0 09 0 0 2 1 0 参考[6]10 0 0 2 0 参考[7]11 0 0 0 0 012 0 0 0 参考[8]13 0 0 0 0 0 1 0 8 0 0 0 5 0 0 表3 不同生长调节剂配比对芽继代繁殖的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA TDZ接种数分化率(%)增值系数 生长势17 30 ++18 30 ++19 30 ++20 30 ++21 30 ++22 30 ++23 30 ++24 30 +25 30 ++26 30 +27 30 ++28 30 +注：++ 表示生长势强；+表示生长势弱。同列中不同字母表示差异显著(P＜＝，表4 同。表4 不同的生长调节剂配比对组培苗生根的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA接种数生根苗数生根率(%)植株生长势29 0 30 19 +30 0 30 21 ++31 30 20 +++32 30 16 ++注：+++ 表示生长势强；++表示生长势中等；+表示生长势弱。第·36· 37 卷3 结 论美人蕉根茎生长在土壤中，无菌化操作较困难。灭菌试验表明，升汞震荡灭菌10min 效果较好，采回的外植体应尽快处理接种，放置时间过长伤口处易染菌，导致接种后褐化较严重。MS + 6-BA + ZDT + NAA 培养基能较好地诱导分化丛生芽，MS + 6-BA + TDZ NAA 为较好的增殖培养基，在增殖培养过程中这两种配方交替使用效果更好；短时间使用高浓度生长调节剂对增殖有促进作用，但长时间使用高浓度生长调节剂会使组培苗质量下降。在试验中还发现，转接次数多的茎尖较转接次数少的分化率大，建议在接种后的10～20d 内及时转接。选用MS + 6-BA + NAA 为生根培养基，生根率较高，根系粗壮、根毛密集，植株生长健壮（图版-d），且移栽成活率较高。参考文献:[1] Segeren W, et al. The genus Canna in Northern South America[J]. Acta Bot Neerl., 1971,20(6): 663-680.[2] 刘文萍,等. 美人蕉茎尖组织培养及快繁技术[J]. 北方园艺, 2001(6): 32.[3] 丁爱萍,等. 美人蕉组织培养及快速繁殖技术[J]. 园林科技, 2006(1): 11-12.[4] Singh N D, et al. The effect of TDZ on organogenesis and somatic embryogenesis in pigeonpea (Cajanus cajan L. Millsp)[J].Plant Science, 2003,164(3): 341-347.[5] 王关林,等. 高活性细胞激动素TDZ 在植物组织培养中的应用[J]. 植物学通报, 1997,14(3): 47-53.[6] 宣朴,等. 生姜茎尖组培快繁技术研究[J]. 西南农业学报, 2004,17(4): 484-486.[7] Kromer K, et al. In vitro cultures of meristem tips of Canna indica L.[J]. Acta Horticulturace, 1985,167: 279-286.[8] Vendrame W A, et al. In vitro propagation and plantlet regeneration from Doritaenopsis Purple Gem 'Ching Hua' flowerexplants[J]. HortScience, 2007,42(5): 1 256-1 258.[9] 刘敏. 花卉组织培养与工厂化生产[M]. 北京: 地质出版社, 2002: 101-102.
论文开题报告ppt
整理资料时,要注意按照问题来组织文献资料,写文献综述时不是将看过的资料都罗列和陈述出来,而是要按照一定的思路将其提炼出来。只有这样,才能写出好的文献综述,也才能写出好的论文开题报告,进而为写出好的论文打下基础。
(3)研究目标具体而不死板
一般论文开题报告都要求明确学位论文的研究目标,但笔者认为,研究目标不宜规定得太死板,这是因为,即使条件一定,目标是偏高还是偏低,往往难于准确判断,研究工作本身,涉及求知因素,各个实验室条件不同,具体研究时条件也不同。学位论文选题和研究目标体现了研究工作的价值特征。
三、论文开题报告的质量保证
为了保证硕士研究生的培养质量,提高论文质量,就必须对论文开题报告进行评价。论文开题报告会由3~5位相关学科的专家对论文开题报告进行评议,与企业合作的重大科研项目可以聘请1~2位相应企业的具有高级职称的专家参加,不同学科的论文开题报告的侧重点不同。江苏工业学院研究生部规定学生必须进行论文开题报告,并规定了统一的格式,设计了专门的论文开题报告评审表,论文开题报告会上研究生应对课题进行详细汇报,并对专家提问做出必要的解释和说明。论文开题报告的成绩考核以合格、不合格记。评审小组成员最后签名并给出学生是否合格的评审意见,并以百分制打出具体的分数。论文开题报告成绩不合格者,不得进入课题研究。
为了提高论文质量,研究生必须首先从思想上重视论文开题报告,在平时的学习中注意积累,从各个方面提高能力,尤其要注意培养通过理论思维发现研究问题的能力。论文开题报告是研究工作的开始,良好的开端为优秀的学位论文奠定了坚实的基础。
1、会计毕业论文:研究的目的和意义
1、1研究的来源:自选
1、2研究的目的:
当前研发费用占我国的gdp支出比例逐渐提高。2006年较2005年上升了11%。2006年我国发布的.新无形资产准则中对研发费用的处理做了全新的规定。如何在新的发展形势和新准则的要求下对无形资产进行计量，管理和报告成为我国会计人员和财务报告使用者马上面临的一个新问题。本文拟从研发费用的定义入手，对国外，国内目前使用的研发费用会计规范进行比较。分析研发费用的资本化，费用化的判断标准;对我国财务人员的挑战和以及应对;对由于开发费用资本化而产生的无形资产如何管理计量;不同的会计规范下研发费用的处理对公司的股票价格有什么影响。如何在财务报告中向报告使用人揭示公司的研究费用和开发资产的信息。同时对我国的新的无形资产准则在未来使用中有可能遇到的问题进行分析。
1、3研究的意义:
我国已经提出建立创新型国家的发展目标。研发费用在未来的经济发展中占gdp的比例会越来越大。我国的企业将来会有更多的资源投入到研究和开发活动中去。同时随我国的上市公司的规模的扩大，公司所有权和经营权的分离会加剧。投资人对财务报告提供信息的要求会越来越高。而研发费用实际上是公司对未来的投资。自2007年起符合条件的开发费用将资本化，在资产负债表上列示。从公司的研发支出中了解公司未来发展趋势，分析管理层对未来的判断必将成为投资者关注的一个重要方面。
2、会计毕业论文:国内外在该方向上的研究现状及分析
2、1国外在该方向上的研究现状及分析:
2、1、1lev:
研究开发支出对公司生产率和产出的贡献极大。估算出的研究开发投资回报率很高。每年为20%-35%。但在不同的行业和不同时期的估算值变化较大。基础研究(目的在于开发新科技的研究)对公司成长率和生产率的贡献远远大于其他类型的研究开发，如产品开发和加工研究开发。基础研究相对于应用研究的贡献差异比为3:1、他同时建议对所有可能产生收益的无形资产投资确认为资产，但这些可能产生的收益无形资产一定是已经通过了特定的技术可行性测试。因为项目的生存的不确定性已经得到 实质性的降低。
2、1、2loudder&behn:
在采用sfas2前，选择将r&d费用资本化并在一定年限摊销的企业的会计利润与股票收益之间的相关性远高于将r&d费用直接及入损益的企业。
2、1、3lev&sorgiannis
研究认为由r&d支出资本化和摊销而产生的研发资产和研发费用与企业价值的相关性要远超过报表收益和企业价值的相关性。
2、2会计毕业论文:国内在该方向上的研究现状及分析
2、2、1薛云奎，王志台一文中对r&d的重要性进行了分析，以1995-1999年作为研究考察区间，考察了我国上市公司r&d信息披露现状及r&d信息披露对我国上市公司会计信息有用性的影响。
研究结果表明，企业对r&d信息的不当披露是导致我国上市公司会计信息有用性逐年下降的重要因素之一。在借鉴国外对r&d信息披露规范的基础上，提出了改进我国上市公司r&d信息披露的建议。
2、2、2茅宁、王晨在<软财务-基于价值创造的无形资产投资决策与管理方法研究>一书中对研发活动功能的演进过程做了如下阐述:直觉型研发，由技术专家主导;系统型研发:研发和企业的核心业务逐渐产生连结关系;战略型研发，研发活动有明确的战略目的，和企业的发展结成紧密关系;知识型研发，针对未来市场发展所需要的未来技术，同时是属于一种不连续的创新。
由于资产化研发费用也是属于无形资产的一部分，他们将无形资产的信息披露分为内部报告和外部披露两部份。认为处于研发初期的有关信息只能在公司内部特定的范围内流动。
2、2、3宋献中，冯敏红在<研发费用逐利性研究>一文中，描述了研发费用的特征:时间性，风险性及特殊性(具有比一般投资活动更大的不确定性;计量困难)。这是因为知识的创造和投入并不一定代表与经济相关的知识存量的增加。
①研发成果转化为真实的生产力需要时间，有的甚至要经过数年才能取得正的现金流量。
②知识本身就是无形的、难以量化的，从而也是难以计量的。
③新知识的投入有可能导致原有知识存量中的部分知识陈旧过时甚至失效。这就使得知识的累计投入不是简单的一加一的关系。研发费用的投入完全在企业经营者控制之下。
投资者了解研发活动具有众多的不确定性。如果对研发活动投入不足，则不足以令投资者产生兴趣;如果对研发活动投入过度，又会令投资者认为投资风险过大，需要重新评估投资的可行性。因此，这种信息传递的作用只有在研发费用披露金额适当的情况下才能达到预期目标。
3会计毕业论文:前期理论研究和试验验证结果:
通过初步对研发费用的定义和世界上两种主要不同的处理规范的研究，得出结论为研发费用部分确认为资产的方式可以提高会计信息在评估企业价值方面的能力。但在目前无形资产信息披露不够全面前提下，研发费用资本化有可能使企业产生利用其调节利润动机。
4会计毕业论文:论文的主要研究内容、实施方案及其可行性论证
4、1主要研究内容和论文的逻辑框架
4、1、1主要研究内容:
⑴对不同的研发费用的定义(国际会计准则，美国会计准则，我国科学技术部)进行分析和比较。由于对研究活动和发展活动的的定义理解的不同，在将来的会计处理的过程中ifrs会有不同的方式处理。准确理解研究与开发活动的内涵和外延极为重要。
⑵。新会计准则下资本化处理方法的优点和缺点:
①符合新经济时代的要求开发费用资本化有利于增强企业的技术创新能力，实现企业价值的最大化，同时为市场对该企业的估值提供了相关的信息。避免了以前会计准则中外购的专利技术均可以记入无形资产中，而企业本身发生的研发费用全部费用化，这种类似性质的业务，会计处理方法却不一致的的事情。
植物组织培养及其应用研究概况在世界各国科学家的不断努力下，近几十年来，植物组织培养技术迅速发展。利用组织培养，不仅可以大量生产优良无性系，获得人类需要的多种代谢物质，还可获得单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体。通过细胞融合可以打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲合性，在植物新品种的培育和种性的改良中发挥了巨大作用。组织培养的植物细胞是在细胞水平上分析研究的理想材料，从植物快繁、花药培养发展到细胞器培养、原生质融合以及DNA重组技术等，植物组织培养技术广泛应用于植物科学的各个领域及农业、林业、工业、医药等多种行业，已经成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。1 植物组织培养的基本概念、原理和试验步骤1．1概念植物组织培养是在无菌条件下，将离体的植物器官(根尖、茎尖等)、组织(形成层、花药组织等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生质体等在人工配制的培养基上培养，给予适宜的培养条件，诱发其产生愈伤组织或潜伏芽或长成完整的植株的技术。1．2原理 植物组织培养的依据是植物细胞的“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德国著名植物学家 G．Haberlandt根据细胞学理论提出了一个观点，“高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞，即植物体细胞，体细胞在适当的条件下具有不断分裂、繁殖并发育成完整植株的潜力”。1943年，美国人White在烟草愈伤组织中偶然发现形成一个芽，证实了G．Haberlandt的论点。 不同植物所需要的生长条件不同，所用的培养基也有所不同。较常用的基础培养基有MT、MS、 SH、N6、White等。在组织培养中，愈伤组织和胚状体能否形成是培育出新植株的关键。通过在基础培养基里添加一定浓度的外源激素，可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官，最终获得再生植株或次生物质。 用于植物组织培养的材料称为外植体，其主要形式有器官、胚胎、单细胞、原生质体等。根据外植体的不同，所需要的培养基种类、培养条件、外源激素的种类及比例等均不同。植物组织培养中，影响培养力的因素是多方面的，诱导愈伤组织成败的关键在于培养条件，植物激素是诱导愈伤组织和绿苗分化的关键因素。最常用的诱导愈伤组织的生长素是IAA、NAA和2，4一D，所需浓度为O．01～10 mg／L。最常用的细胞分裂素是KT和ABA，使用浓度为O．1～10 mg／L。KT的主要作用是促进细胞分裂和愈伤组织分化。ABA对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。各类植物激素的生理作用虽有相对专一性，但是植物的各种生理效应是不同种类激素之间相互作用的综合表现。1．3试验步骤1．3．1选择和配制培养基 培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。1．3．2灭茵灭菌是组织培养中的重要工作之一，通常采用物理的或化学的灭菌方法。培养基用常压或高压蒸煮等湿热灭菌、器械采用灼烧灭菌、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌、不耐热的物质采用过滤灭菌、植物材料表面用消毒剂灭菌、物体表面用药剂喷雾灭菌、接种室等空间采用紫外线或熏蒸灭菌。1．3．3接种将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块放入培养基，整个接种过程要在无菌条件下进行。 ．4培养把培养材料放在有一定光照和温度等条件的培养室里，使之生长、分裂和分化，形成愈伤组织或进一步分化成再生植株。1．3．5试管苗驯化移栽 试管苗是在特殊环境条件下生长的幼苗，与自然生长的幼苗有很大差异，只有通过驯化，使之适应自然环境后才能移栽。2 植物组织培养的应用2．1植物快速繁殖和无病毒种苗生产植物快速繁殖技术始于20世纪60年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功，从此揭开了植物快速繁殖技术研究和应用的序幕。目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有100多科1 000种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界上80％～85％的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。培养的植物种类也由观赏植物逐渐发展到园艺植物、大田作物、经济植物和药用植物等。在我国，同类的研究始于20世纪70年代。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植，30余种植物已进行规模化生产或中间试验。利用组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。2．2植物花药培养和单倍体育种 将植物花药培养成单倍体植株，再经过染色体加倍，能很快得到纯合的二倍体，这样将大大缩短育种年限。到目前为止，世界上通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。印度科学家应用这种方法培育的水稻品系，比对照产量提高15％～49％。韩国先后育成了5个优质、抗病、抗倒伏的水稻品种。我国自20世纪70年代开始该领域的研究，已经培育了40余种由花粉或花药发育成的单倍体植株，其中有10余种为我国首创。玉米获得了100多个纯合的自交系；橡胶获得了二倍体和三倍体植株。仅“九五”期间就育成高产、优质、抗逆、抗病的农作物新品种44个，种植面积超过660万 hm2。2．3植物胚胎培养杂交育种中，杂种胚常常败育，因此将早期生长的胚取出，应用组织培养方法，就有可能培育出杂交植物。已经有100篇以上幼胚培养成为植株的报道。国内外科学家应用植物胚胎培养技术获得了多种远缘杂交的重组体、栽培种和杂交品种。2．4植物愈伤组织或细胞悬浮培养利用植物愈伤组织或细胞悬浮培养可以生产用于预防和治疗疾病的植物次生代谢产物。近年来，这一领域的发展极为迅速，已经研究了400多种植物，从培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于原植物，20种以上干重超过原植物的1 9，6。例如，从薯芋愈伤组织和悬浮细胞生产的diosgenin用于合成甾体药物。最近抗癌药物紫杉醇一红豆杉细胞培养物，可用75t发酵罐培养，已达到商业化生产水平。另外，达到商品化水平的还有紫草、人参、黄连、老鹳草等；长春花、毛地黄、烟草等已实现工业化生产；牙签草、红花等20多种植物正在向商品化过渡。2．5细胞融合与原生质体培养自1960年英国学者Cocking首次利用纤维素酶从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功以来，到1990年已有100种以上植物的原生质体能再生植株。我国获得了30余个品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物，如大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、棉花等。在木本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。国外已先后获得了种内及种间的体细胞杂种植株。植物原生质体培养还可应用于外源基因转移、无性系变异及突变体筛选等研究，因而越来越受到人们的重视。2．6植物细胞突变体筛选植物细胞突变体的筛选最早始于1959年，G． Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。1970年，P．S．Carlson，H．Binding和Y．M． Heimer等分别分离出烟草营养缺陷型细胞、矮牵牛抗链霉素细胞系及烟草抗苏氨酸细胞系。迄今为止，已经在不少于15个科45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的植物细胞突变体或变异体。其中包括抗病细胞突变体，如玉米抗小斑病突变体和小麦抗赤霉病、根腐病突变体；抗氨基酸及其类似物细胞突变体，如甘蓝型油菜抗HYP突变体[263；抗逆境胁迫细胞突变体，如水稻耐盐突变体和小麦抗盐突变体；抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体，如玉米抗除草剂变异体；株高突变体的筛选，如水稻矮秆变异体。2．7植物体细胞胚胎和人工种子1958年，Reinert在胡萝卜的组织培养中最先发现了体细胞胚胎(胚状体)。据不完全统计，能大量产生胚状体的植物有43科92属100多种。一些重要作物如水稻、小麦、玉米、珍珠谷等，也能通过离体培养产生胚状体。这些胚状体用褐藻酸钠等包埋，再加上人工种皮，就形成了人工种子。人工种子的优点是：繁殖快速，成苗率极高；不受气候影响，四季皆可工厂化生产。上世纪80年代初，美、日、法等国家相继开展了人工种子的研究，我国也于“七五”期间开展了此项研究，并于1987年列入了国家“863”高技术研究发展计划。2．8 植物组织细胞培养物的超低温保存与种质库建立植物细胞全能性的发现和证实，为植物种质资源的长期保存开辟了一条新途径。采用液氮超低温保存技术，能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如建立茎尖分生组织培养物的超低温保存种质库，不仅可以防止种质的遗传变异和退化，而且可以长期保存无病毒的原种。2．9 植物组织培养与转基因技术的应用 我国第一个T—DNA插入突变体库的构建和研究为我国水稻功能基因组学研究奠定了良好的技术和材料基础，为确保我国拥有一批有自主知识产权的基因资源做出了积极贡献。由中国水稻研究所农业部水稻生物学重点开放实验室和中科院上海植物生理研究所合作，通过建立大规模、高效的农杆菌介导的转基因技术体系，将玉米转座子Ac—Ds等外源基因导入水稻未成熟胚和种子诱导的愈伤组织，获得了1．2万个独立的T—DNA插入株系，并构建了水稻突变体的数据库。 3 展望植物组织培养研究与应用是20世纪科技进步的重大成果之一，为研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官发生与胚胎发生等提供了许多良好的实验材料和有效途径。植物组织培养方法不断提高的同时，也相应拓宽了其应用范围。由于组织培养在人工控制的条件下进行，容易掌握花芽分化和开花成因；通过胚胎培养，能够得到杂种或自交种；通过分离单倍体细胞，能培育纯合的二倍体优良品系；提高育种多样性的同时缩短了育种时间；通过突变体筛选，提高植物的品质，增强抗逆境胁迫能力，扩大植物的生长范围；将体细胞冷藏在低温下，建立基因库，达到保存物种的目的；获得药用价值高和工业生产所需要的次生产物，加快药物生产的时间并且减少了单纯依靠天然植物的被动性。植物组织培养技术已经渗透到科研、生产和生活各个领域，必将日臻完善。黑龙江农业科学2006，(3)
学术堂最新整理了一部分关于园艺论文的参考题目:1、西藏园艺产业发展与农牧民增收致富探讨2、基于问题的园艺植物育种学探究式教学模式研究3、从指导教师角度谈园艺专业大学生科研训练计划项目的实施4、台风对浙江省设施园艺的影响及防避措施5、多倍体育种在园艺作物中的应用6、园艺专业观赏植物病虫害防治课程教学改革的探索与实践7、提高职业教育中园艺技术专业实习课教学质量的几点思考8、复合应用型园艺专业人才培养模式探讨9、探究设施园艺中的土壤生态问题及其清洁生产10、建设高校园艺实习基地培养农业科技人才11、云斑白条天牛对园艺作物的危害及习性12、园林园艺类中高职里面课程结构衔接对策13、现代园艺专科人才分类培养的探索与实践14、园艺植物繁殖学教学改革探索15、设施园艺智能化发展趋势与路径16、果树园艺技术与果树营养诊断策略之我见17、施用外源物质对园艺作物抗逆性影响研究进展18、"园艺产品贮藏与加工"课程教学改革探析19、高职园艺技术专业实践教学改革初探20、提高"园艺植物研究法"教学质量的探讨
我先前也是对论文的写作非常非常头大，还好后来找闻闻论文网的老师帮忙才搞定。论文里面的核心部分，分析和数据处理是最难的，包括我身边的一些同学写到一半写不下去了，我都介绍的闻闻论文网给他们，非常专业，有的甚至把整篇都找帮忙的。
园艺方面的毕业论文轻风论文网很多啊，可以看下
DOAJ (Directory of Open Access Journals) （免费期刊）全文数据库（电子期刊） (BioMed Centeral)（提供120余种生物医学期刊免费全文）(检索需注册登录) Centeral)（美国NCBI建立的数字化生命科学期刊文献集，现提供50余种生物医学期刊免费全文）
收稿日期：2007-10-25基金项目：深圳市科技和信息局基金资助项目作者简介：王丹（1982-），女，辽宁本溪人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。注：雷江丽为通讯作者。大花美人蕉茎尖组织培养技术研究王 丹1,2，雷江丽2，吴燕民3，吕 慧2，郁继华1(1.甘肃农业大学 农学院，甘肃 兰州 730070；2.深圳市园林科学研究所，广东 深圳 518003；3.中国农业科学院 生物技术研究所，北京 100081)摘 要：以大花美人蕉（Canna×generalis）根茎茎尖为外植体进行组织培养技术研究，筛选出芽诱导适宜的培养基为MS + 6-BA （单位下同）+ TDZ ；MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基能较好地诱导分化出丛生芽, 继代增殖培养中与MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基交替使用可减少畸形芽，增殖系数达；适宜的生根培养基为MS + 6-BA + NAA ，生根率达，且植株生长健壮，移栽易成活。关键词：大花美人蕉；茎尖；组织培养中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2008)01-0033-04Research on Shoot-tip Culture of Canna×generalisWANG Dan1,2, LEI Jiang-li2, WU Yan-min3, LÜ Hui2, YU Ji-hua1( of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu China; Institute of LandscapeGardening, Shenzhen 518003, Guangdong China; Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Beijing 100081, China)Abstract: The paper mainly studied on tissue culture of Canna×generalis with the stem tips asexplants. The results showed that the bud inoculation medium was MS + 6-BA ; the best of clump shoot induction and differentiation medium was MS + 6-BA +TDZ + NAA ; using MS + 6-BA + TDZ + NAA asproliferation medium, an optimal proliferation rate was obtained. When the two kinds of mediumused alternatively, the effect was better. The optimum rooting medium was MS + 6-BA +NAA , the rate of rooting could reach , and cultured in this medium, the plant grewwell and easy to words: Canna×generalis; shoot-tip; tissue culture大花美人蕉(Canna×generalis)属美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的园艺杂交种[1]，是多年生喜光宿根草本花卉，原产美洲热带和非洲等地。其枝叶茂盛、花朵艳丽、姿态优美、花期长，在深圳地区几乎全年开花，是配置大型花坛的优良品种。大花美人蕉不仅观赏价值高，而且能吸收硫、氯、氟、汞等有害物质，具有净化空气、保护环境的作用，因此，世界许多城市的园林绿化中都广泛应用。美人蕉传统的繁殖方式主要采用分切地下根茎的方法，繁殖速度慢、增殖效率低，而且连续营养繁殖造成病毒积累致使病毒病在各地相当普遍，严重影响其观赏价值。利用茎尖组织培养进行脱毒试管苗快繁，是目前大力繁殖与推广美人蕉的主要手段。关于美人蕉组织培养的研究报道较少[2,3]，本研究探索其组织培养高效的再生体系，以期为品种提纯复壮及遗传转化、性状改良奠定基础。2008,37(1): Plant Science第·34· 37 卷1 材料与方法 材料供试材料为目前城市绿化中普遍应用的大花美人蕉‘President’品种。 外植体选择与处理选择生长健壮、无病虫害的优良母株，挖取带芽胞的根茎，去除表面老皮并用肥皂水清洗。用75%乙醇棉擦拭，然后采用不同的消毒剂及处理时间（升汞10min、2%次氯酸钠10min、2%次氯酸钠20min、2%次氯酸钠 + 升汞5min、2%次氯酸钠 + 升汞10min），封闭式振摇灭菌。无菌水冲洗5 次，置于超净工作台上备用。接种前，剥去外部叶片，露出生长点，立即切取茎尖进行接种。 培养方法及培养条件试验于2006 年10 月在深圳市园林科学研究所组培室进行。诱导、增殖和生根培养基均选用MS为基本培养基，在不同培养阶段附加不同种类、不同浓度配比的植物生长调节剂（表2～表4），蔗糖3%，pH 。培养温度(28±2)℃，光照强度2 500 lx，光照周期为14h/d，相对湿度70%～80%。每处理接种30 瓶。定期观察试管苗生长与分化情况。2 结果与分析 不同消毒处理方式对外植体无菌化的影响因供试外植体取自美人蕉地下根茎，表面污染物较多，不易消毒，且不同植物及外植体的成熟度对消毒剂的反应不同，故本试验选用升汞和次氯酸钠进行灭菌效果比较，以筛选合适的消毒剂及消毒处理时间。由表1 可知，2%次氯酸钠20min 处理的无菌化效果较好，但茎尖褐化较严重，说明灭菌时间过长对去老皮后的幼嫩根茎影响较大。升汞10min 处理与2%次氯酸钠 + 升汞 10min处理，无菌化效果差异不大，但2%次氯酸钠 + 升汞 10min 处理有轻微药害。因此，后续实验选用升汞处理10min 进行外植体消毒。 不同生长调节剂配比对芽诱导的影响以MS 为基本培养基，附加不同浓度6-BA、NAA、2,4-D、KT、TDZ 等（表2），以筛选出较适宜美人蕉茎尖诱导分化的配方。因美人蕉根茎具有休眠特性，芽诱导分化较难。TDZ 具有很强的促进细胞分裂活性，～μmol/L 即可有效促进分化[4]，因此，本实验对TDZ 的诱导效果进行初步探索。试验表明，在不添加任何生长调节剂的MS 基本培养基（1 号）上，茎尖接种10d 后开始生长，叶片展开后，生长停止；15d 后转接到新的MS 培养基上无明显生长，随后叶片逐渐变黄、萎蔫，说明基本培养基中添加生长调节剂是美人蕉离体培养的必要条件。在仅添加6-BA 的2、3、4 号培养基中，高浓度的2 号培养基分化率为，明显好于3、4号培养基，说明美人蕉启动芽诱导分化需要高浓度的细胞分裂素（表2）。11～16 号培养基添加物为不同生长调节剂与TDZ 组合（表2）。仅添加TDZ 的培养基分化率为0，而多种生长调节剂配合使用分化效果更好[5]。其中15 号培养基的侧芽分化率最高，达，且每个茎尖可增殖2～3 个侧芽，但个别茎尖经多次转接后有畸形芽；与2 号培养基相比，分化率明显提高，说明添加低浓度TDZ 可促进芽诱导分化（表2）（图版-a）。5、6、7 号培养基为生根培养基，探讨NAA 对美人蕉茎尖生长和生根的影响。试验结果初步说明美人蕉在6-BA/NAA 小于2/ 时生根率可达50%以上（表2）。8、9、10 号培养基，探讨美人蕉脱分化，诱导愈伤组织，但结果均不理想。因此，建立高效的美表1 不同消毒剂及处理时间对外植体无菌化的影响处 理 接种数污染数污染率(%) 药害情况升汞10min 30 5 基本无药害2%次氯酸钠10min 30 12 无药害2%次氯酸钠20min 30 4 20%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞5min 30 10 3%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞10min 30 5 7%有药害第1 期 王丹,等：大花美人蕉茎尖组织培养技术研究 ·35·人蕉遗传转化再生体系还需进一步探索愈伤组织诱导途径。 芽继代增殖为了探讨优化的芽继代增殖培养基配方，按表3 设计6-BA、NAA、TDZ 的正交实验，以15 号培养基上分化出的丛生芽为接种材料，进行继代增殖培养（图版-b）。由表3 可见，除17、18 号培养基外，低浓度TDZ（）的分化促进作用较高浓度（）的效果好，说明高活性的TDZ 浓度过高反而抑制分化。当 时, NAA 促分化作用显著优于。在TDZ、NAA 浓度相同的情况下，随着6-BA 浓度的升高，分化率提高。但随着继代次数的增多，含高浓度6-BA的27 号培养基分化率略有下降，甚至有个别畸形芽产生，说明高浓度细胞分裂素对短期的分化有促进作用[9]，但继代数次后，芽已经萌动，自身具有分化能力，需适当降低6-BA 浓度进行壮苗，以避免畸形芽产生。因此，在增殖过程中交替使用分化增殖系数较高的19 号培养基和27 号培养基，既可保证较高的芽分化率，又可使继代苗生长健壮，减少畸形芽。 生根诱导增殖芽3～5cm 长时，转接到生根培养基上培养约10d 后，可见到根生成（图版-c）。接种20d 后统计生根结果（表4）。从表4可见，所用培养基上都有根生成，说明美人蕉生根较容易；结合生根率和生长势，我们认为MS + 6-BA + NAA 培养基较适宜美人蕉生根。表2 不同植物生长调节剂组合的比较植物生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA 2,4-D KT TDZ分化率(%) 生根率(%) 备注1 0 0 0 0 02 9 0 0 0 0 参考[2]3 5 0 0 0 0 参考[3]4 3 0 0 0 0 2 1 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0 08 0 0 4 0 09 0 0 2 1 0 参考[6]10 0 0 2 0 参考[7]11 0 0 0 0 012 0 0 0 参考[8]13 0 0 0 0 0 1 0 8 0 0 0 5 0 0 表3 不同生长调节剂配比对芽继代繁殖的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA TDZ接种数分化率(%)增值系数 生长势17 30 ++18 30 ++19 30 ++20 30 ++21 30 ++22 30 ++23 30 ++24 30 +25 30 ++26 30 +27 30 ++28 30 +注：++ 表示生长势强；+表示生长势弱。同列中不同字母表示差异显著(P＜＝，表4 同。表4 不同的生长调节剂配比对组培苗生根的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA接种数生根苗数生根率(%)植株生长势29 0 30 19 +30 0 30 21 ++31 30 20 +++32 30 16 ++注：+++ 表示生长势强；++表示生长势中等；+表示生长势弱。第·36· 37 卷3 结 论美人蕉根茎生长在土壤中，无菌化操作较困难。灭菌试验表明，升汞震荡灭菌10min 效果较好，采回的外植体应尽快处理接种，放置时间过长伤口处易染菌，导致接种后褐化较严重。MS + 6-BA + ZDT + NAA 培养基能较好地诱导分化丛生芽，MS + 6-BA + TDZ NAA 为较好的增殖培养基，在增殖培养过程中这两种配方交替使用效果更好；短时间使用高浓度生长调节剂对增殖有促进作用，但长时间使用高浓度生长调节剂会使组培苗质量下降。在试验中还发现，转接次数多的茎尖较转接次数少的分化率大，建议在接种后的10～20d 内及时转接。选用MS + 6-BA + NAA 为生根培养基，生根率较高，根系粗壮、根毛密集，植株生长健壮（图版-d），且移栽成活率较高。参考文献:[1] Segeren W, et al. The genus Canna in Northern South America[J]. Acta Bot Neerl., 1971,20(6): 663-680.[2] 刘文萍,等. 美人蕉茎尖组织培养及快繁技术[J]. 北方园艺, 2001(6): 32.[3] 丁爱萍,等. 美人蕉组织培养及快速繁殖技术[J]. 园林科技, 2006(1): 11-12.[4] Singh N D, et al. The effect of TDZ on organogenesis and somatic embryogenesis in pigeonpea (Cajanus cajan L. Millsp)[J].Plant Science, 2003,164(3): 341-347.[5] 王关林,等. 高活性细胞激动素TDZ 在植物组织培养中的应用[J]. 植物学通报, 1997,14(3): 47-53.[6] 宣朴,等. 生姜茎尖组培快繁技术研究[J]. 西南农业学报, 2004,17(4): 484-486.[7] Kromer K, et al. In vitro cultures of meristem tips of Canna indica L.[J]. Acta Horticulturace, 1985,167: 279-286.[8] Vendrame W A, et al. In vitro propagation and plantlet regeneration from Doritaenopsis Purple Gem 'Ching Hua' flowerexplants[J]. HortScience, 2007,42(5): 1 256-1 258.[9] 刘敏. 花卉组织培养与工厂化生产[M]. 北京: 地质出版社, 2002: 101-102.
可以上QQ搜索相关的QQ群~然后寻找帮助~~
育种方法有多种，而经常采用的是杂交育种。因为杂交育种可产生杂种优势。但培育一个杂交新品种至少也得花5～7年时间。而且，产生的杂种也不是个个都是良种，其中有相当多的株型是无用的，需要仔细地从杂种后代中选出高产、优质、抗病虫害的好品种，经过多年栽培，使其遗传性稳定，才能推广。
育种学家经过观察研究发现，在杂种一代进行花药培养，可以大大缩短培育新品种的时间。因为花药的花粉是性细胞，用它可直接进行培养得到植株。例如水稻品种“垦桂”，它产量高，穗大，但不抗虫；而另一个品种“科情3号”穗小，但抗病虫害。将它们杂交，得到杂交种，出现4种类型：抗虫小穗型、抗虫大穗型、不抗虫小穗型和不抗虫大穗型。因此，只需要用抗虫大穗的花药进行组织培养，就可以比较快地得到新的水稻品种，使育种效率提高4倍。
不过，需要说明，花粉直接培养不能得到植株，必须先用花药培养，使花药上的花粉与雌性细胞结合形成胚以后，才能产生植株。
花药培养的优越性显而易见，深受育种学家的欢迎。我国是世界上采用此技术育种并取得多项重要成果的国家，其先进性有目共睹。不论是水稻还是小麦，我国均培育出了不少优良新品种，为农业生产作出了重大贡献。
花药离体培养是一种组织培养技术，其过程是： 1、把花粉发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上进行离体培养； 2、花粉在培养基所提供的特定条件下可以发生多次分裂，形成类似胚胎构造的愈伤组织； 3、诱导愈伤组织分化出芽和根，最后长成植株。 单倍体育种是一种育种方法，其过程是： 在花药离体培养的基础上，用秋水仙素继续处理单倍体幼苗，使染色体数目加倍，重新恢复为二倍数。因为它们的二倍数染色体是由单倍数染色体本身加倍而来的，所以都是纯系，自交后代不会发生性状分离，因此在育种上有很高的应用价值。