基因的瞬时表达载体构建论文模板

首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。

先回答你的问题，转入外源基因的农杆菌不能较载体，它本身是外源基因的受体，携带外源基因的质粒或者噬菌体才是载体。你想问基因表达载体的构建，这个问题太大，而且表达载体多种多样，用处也很多，所以很难一下子概况。我只能大概说一下：原理：将外源基因片段与载体连接（载体通常选用质粒或者噬菌体或其他病毒），将重组的载体转染受体细胞，使之整合入宿主基因组或者在稳定存在于胞质内，是宿主细胞能够表达载体上的外源基因，从而获得新性状或者新产物。大概步骤：1）从基因组或cDNA上克隆得到完整的目的基因（至少包含CDS区），通常在两端加粘性末端或重组位点2）选择合适的表达载体（真核、原核、噬菌体、某些病毒、标记等）3）将克隆得到的目的基因与载体连接4）将重组载体通过某种手段转入受体，即宿主中（化学转染、脂质体、电转、显微操作等）5）筛选阳性的宿主细胞并扩繁

一、载体的选择过表达载体主要是将目的基因的编码区（CDS）构建到相应的质粒或者病毒载体中，达到在目的基因过量表达的作用。常规过表达载体主要元件：Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗药筛选gene。基因过表达载体又可以分为广泛启动子基因表达载体，组织特异性启动子基因表达载体和诱导启动子基因表达载体等，以达到不同研究所需要的目的。根据不同研究需要，选择合适的过表达载体。二、目的基因的获得调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中通过PCR的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得想要的基因片段。全基因合成：根据目的基因的DNA序列，直接通过公司合成目的基因。优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高目的基因在宿主内的表达量。三、载体构建实验方法1.引物设计：酶切酶连方法的引物设计：设计特异性的目的片段扩增引物，引物的长度一般为18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之间GC含量不能相差太大，引物中需要加入两个合适的酶切位点（需要扩增的目的片段上无选择的酶切位点）及保护性碱基。引物设计不当可能在扩增时生成引物二聚体，给实验带来不便。同源重组方法的引物设计：设计引物时上游引物5’端前面加的是酶切位点及该酶切位点在载体中对应前面的15个碱基载体片段，下游引物5’端前面加的是相同的酶切位点及该酶切位点在载体中对应后面的15个碱基载体片段，如此设计引物是为了保证目的片段插入载体时方向正确，将目标片段扩增出来后以便与载体连接。扩增：以研究对象的DNA/cDNA为模板，PCR扩增目的基因，在引物两端分别引入合适的酶切位点，使用1%琼脂糖凝胶（根据片段大小选择不同浓度的琼脂糖凝胶）电泳检测和回收回收目的基因DNA条带。3.载体和目标片段的限制性酶切：质粒载体和目的基因PCR产物的进行双酶切；使用琼脂糖凝胶（根据片段大小选择不同浓度的琼脂糖凝胶）电泳检测和回收1%琼脂糖凝胶电泳分别回收载体片段部分质粒载体酶切大片段和目的基因酶切片段。4.连接转化：使用DNA连接酶进行载体片段部分和目的基因酶切片段质粒酶切回收大片段与目的基因连接的连接，连接反应在16℃反应12 h小时。取10 µL连接产物与100 µL DH5α感受态细胞细菌混匀后冰浴30 min，42℃热激90 s，立即置冰上放置5 min，加入预热至室温的700 µL LB培养基， 37℃恒温摇床培养50 min，吸取 200 µL的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含100 µg/mL Ampicillin抗性的LB平板上（根据载体上的抗性筛选标记选择合适的抗性平板，以 Ampicillin抗性为例）， 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。5.挑取克隆提质粒验证：（1）菌落PCR验证：挑取5-10个单菌落直接进行PCR验证。（2）酶切验证：PCR验证阳性的菌落接种于含5 mL，100 μg/mL Ampicillin抗性的LB培养液中，300 rpm，37℃恒温摇床培养过夜。收集菌体，使用，对过夜的菌液进行扩增，选择阳性菌液，用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒进行酶切验证。（也可以不进行酶切验证，直接进测序验证。）（3）测序验证。