细胞工程论文英文文献

不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的dna时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的dna大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、pcr反应等有较强

植物细胞工程所谓细胞工程，是指以细胞为基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品。 细胞工程根据研究材料的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程，均主要由两部分构成。 其一是上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。 第二则是下游工程，是将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程。 其中细胞培养是细胞工程的技术基础。 顾名思义，植物细胞工程，是在细胞水平上针对植物细胞的细胞工程，它是细胞工程的一个重要组成部分。 自1904年Hanning成功培养离体胚以来，伴随着相关理论与技术的飞速发展，植物细胞工程也取得了巨大的成就。现在，我们已经可以利用细胞融合及DNA重组等现代生物技术从细胞和分子水平改良现有品种甚至于组建新品种。1983年转基因植物问世，并于1986年起被批准进入田间试验，美国APHIS到97年1月31日已批准多达两千五百八十四例田间试验。不仅如此，一些转基因植物已经开始进行商业化生产。从1994年Calgene公司的延熟番茄FLAVRSAVRTM成为首例被批准进行商业化生产的转基因作物开始，其后截止至1997年1月，美国已批准十七例，加拿大十八例，澳大利亚四例，日本七例。我国农业部也已于97年上半年批准了转基因延熟番茄的商业化。由此可见，植物细胞工程将对我们的生活产生越来越大的影响，我们应对此加以重视，了解一些新的研究成果及新技术，以求在生物工程这个二十一世纪的龙头产业中占有一席之地。 植物细胞工程涉及诸多理论原理及实际操作技术，首当其冲的自然是培养技术，也就是将植物的器官、组织、细胞甚至细胞器进行离体地、无菌的培养。它是对细胞进行遗传操作及细胞保藏的基础。此类技术发展起步较早，相对而言已比较成熟，各种培养基制备及很多操作方法已经基本规范化。针对植物的培养主要有植物组织培养、植物细胞培养、花药及花粉培养、离体胚培养以及原生质体培养这几个大类，每一种都还可可以继续细分为更具体的小类。组织培养首先将外植体分离出来，然后在无菌及适当条件下培养以诱导出愈伤组织，另外在愈伤组织随外植体生长一段时间后还需要进行继代培养，以避免代谢产物积累及水分散失等因素的影响。细胞培养可分为悬浮细胞培养、平板培养、饲养层培养和双层滤纸植板几类，它们都是将选定的植物细胞于适当的条件下进行培养，以得到大量基本同步化的细胞，为遗传操作提供材料。花粉及花药培养主要是使花粉改变正常发育途径而转向形成胚状体和愈伤组织，从而产生单倍体植株。离体胚培养有幼胚与成熟胚培养两类，通过使用相应的培养基使离体胚正常的萌发生殖，以供研究和操作使用。原生质体的培养则是一切利用原生质体进行遗传操作的基础，它是将取得的植物细胞去除细胞壁形成原生质体后进行培养，具体方法与细胞培养有一定的相似之处。作为后继操作的基础，培养技术的选择是非常重要的。采用适当的培养方法可以更好地进行遗传操作和保存细胞，而错误的选择是有可能影响结果甚至导致试验和生产失败，造成时间和金钱的浪费。 仅仅对细胞进行培养是不够，要使培养的细胞能为人类服务，就要对其进行一定的改造，这就涉及到了细胞的遗传操作。可以说，遗传操作是整个细胞工程中最为重要也最具挑战性的一环。它极大的依赖于理论原理、操作技术以及设备的发展。随着基因组学的发展，各项基因组计划正在紧锣密鼓地进行，由于DNA序列分析方法的革新，诸如高效毛细管自动化测序、DNA芯片法以及大规模平行实测法的应用大大加快了基因组计划的进程。拟南芥基因组计划将于2004年完成，水稻、番茄和玉米基因组的测序也正在进行。是类计划所提供的信息将不断定位大量有价值的基因，而最近的研究还表明影响作物产量的可以是单基因的改变而不仅仅是多基因决定。所有这一切的基础研究都为遗传操作提供了更多、更准确的理论依据。实验技术的发展则使精确、高效的遗传操作变得更加方便。将外源DNA导入靶细胞的方法不断完善，除了以前经常使用的质粒载体、病毒载体、转座因子和APC（酵母人工染色体）等途径外，通过lipoplex\polyplex介导、裸DNA、"基因枪"、超声波法和电注射法等非病毒方式转换细胞的方法也开始被广泛的使用；细胞融合方法已被不断的改进，融合率增大；细胞诱变也取得了较大的进展，诱变方式不断增加。这些理论和技术的发展都为更好的改造细胞创造了条件。 培养或改造好的细胞是进行研究和生产的基本材料，为了使其不致死亡并尽量保持优良的特性，就需要进行适当的保藏。一般是根据细胞的特点，人工创造条件使其生长代谢活动尽量降低，处于休眠状态，以抑制增殖和减少变异。作为世界上最大的细胞库，ATCC早在92年就已经有了三千两百多个细胞系入库，而且数量还在不断增加。此外还有CSH(美)、NCTC(英)、NRRL(英)、KCC(日)等著名的保藏机构，国内也有一些较为大型的机构，足见各国对细胞保藏的重视。由于植物细胞有其自身的特点，因而其保藏方法不可能与微生物完全相同。通常采用的方法是液氮超低温保藏方法。这种方法利用液氮的温度可以达到-196，远远低于一般细胞新陈代谢作用停止的温度（-130℃）从而使细胞的代谢活动停止，化学作用随之消失，达到长期保藏的目的。操作时要注意从常温到低温的过渡，以使细胞内的自由水通过膜渗出，避免其产生冰晶而损害细胞。另外还有低温冻藏法及其他一些保藏方法，但多用于短期保藏。 细胞工程的目的，是得到人们所需要的生物产品。要使已经改造好的细胞产生大量具有经济价值的产物，就必须依靠下游加工过程，也就是我们常说的下游工程。它的作用就是大量培养细胞，并从培养液中分离、精制出有关的生物化工产品。由于植物细胞的高度易碎性，对剪切力的敏感、细胞有去分化和聚集作用，增殖时间长等独特性，使其大规模培养技术明显比微生物和动物细胞的发展缓慢。但通过不懈的努力，现在已经具备在2万升规模的生物反应器中培养烟草细胞的能力。而日本的三井石化也已经在使用750L发酵罐通过培养植物细胞而生产紫草宁，且产量较高，可满足全日本百分之四十上的需要。相信随着理论以技术的不断完善，植物细胞的大规模的培养将会很快的成为一种常规的生产手段。培养后的培养物经过处理后被分离、提纯。分离和精制过程所需的费用在整个生产过程中的占有很大的比例，一般为60%，有些甚至高达80-90%，而且还有继续加剧的取向。因此该过程的落后也可能阻碍细胞工程的发展。世界各国现在已经都比较重视这个问题，英国早在83年就发起了生物分离计划(BIOSEP)，专门研究分离与精制，我国也曾经召开过专门会议。分离与精制的困难是由于培养液自身的理化特性所决定，这就需要在上游工程时就考虑到这方面的问题，同时不断推出新的分离纯化技术及方法，从而简化过程、降低成本，这在实际生产中是很重要的。 诚然，细胞工程的伟大和神奇确实令人惊叹不已，但随着这一类技术的迅猛发展，基因产品的广泛应用，其安全性已引起了人们的广泛关注。虽然从本质上来讲，转基因植物和常规育成的品种是一样的，两者都是在原有品种的基础上对其一部分进行修饰，或增加新特性，和消除原来的不利性状，但是，以前所用的有性杂交仅仅局限于种类和近缘种之间，而转基因植物却大胆突破了这一局限，其外源基因可以来自植物、微生物甚至动物。在这种情况下，人们对可能出现的新组合、新性状是否会影响人类健康和生物环境还缺乏足够的认识和经验。至少从目前来说，我们还不可能很精确的预测某一个外源基因在新的遗传背景中会产生什么样的相互作用。并且，转基因植物还可以对它所在的环境产生一定的影响。比如现在应用最多的抗除草剂基因就可能通过同属野生植物异花传粉而逐渐扩散进入自然界，从而使杂草的控制变得更加困难；而抗虫、抗病基因也有可能通过类似的途径转移到环境，给野生种群带来选择优势而变得无法收拾。虽然现在一般通过生殖隔离（设置缓冲作物带和隔离区）来防止基因漂流至临近作物，但若进行大规模生产和推广时就会难于加以控制。另外，转基因作物还可能造成对微生物的影响，Hoffman等就曾发现转基因油菜中的基因可转至黑曲霉中，虽然机制还不明确，但至少存在这个事实。自然界中存在着植物病毒间异源重组，病毒的异源包装（转移包装）可以改变其宿主范围。转基因植物表达的病毒外壳蛋白在体外实验中可以包装入侵的另一种病毒的核酸，产生一种新病毒，虽然在小规模的田间实验中并未发现这种情况，但长期的大规模生产应用中是否也是怎样呢？此外，公众对转基因植物的接受性和标签问题得到也是我们应该考虑的问题。 由此可见，细胞工程是一柄双刃剑，在造福于人类的同时也可能毁灭人类，甚至整个地球。这就要求我们在大力发展的同时注意其安全性，不断完善理论以技术，使其更好地为人类服务。 基因工程与它不一样！！！！植物体细胞杂交 植物体细胞杂交（Somatic hybridization）,又称原生质体融合（Protoplast fusion ）是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞具有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细胞融合也称为原生质体融合。 植物细胞杂交的几个重要进展 1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1970年，Power首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生质体诱导融合； 1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株； 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物细胞杂种； 1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术； 1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）； 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念； 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。 分类 根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类：  对称融合（asymmetric fusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。  非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，它可以分为几种： 用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类：  物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，它们能使细胞核失活；  化学处理目前常用的试剂有，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。 过程 将植物细胞A与植物细胞B用纤维素酶和果胶酶处理，得到不含细胞壁的原生质体A和原生质体B，运用物理方法或是化学方法诱导融合，形成杂种细胞，再利用植物细胞培养技术将杂种细胞培养成杂种植物体。 ①杂交时间：植物细胞杂交是从细胞融合开始，到培育成的新植物体结束。 a.原生质体制备：用酶解法去除细胞壁（纤维素酶和果胶酶） b.原生质体融合：膜融合（高钙、高pH诱导融合）、核融合（杂种细胞第一次有丝分裂时融合） 原生质体的融合 一、融合方法 1．PEG诱导融合法  PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较 高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。  PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极 性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在原生质体之间形成分子桥，其 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授 结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动 性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。  融合技术要点： 融合液：CaCl2·2H2O 8~10mmol KH2PO4 甘露醇或山梨醇 pH 诱导液：融合液＋PEG 20～45％ 稀释液：A液（g/100ml） B液（g/100ml） 葡萄糖 甘氨酸 CaCl2·2H2O NaOH DMSO 10ml 2．电融合法  与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效 率高；三是融合技术操作简便。  电融合仪的结构特点：一是交变电场部分；一是高频直流电击部分。  电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生 质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体 紧密接触排列成串； P1 P2 P1 P2 混合静止1min. 融 合 融合液 加入PEG 稀 释洗 涤 加入稀释液 加入培养基 培 养 选 择 华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而 导致两个紧密接触的细胞融合在一起。  关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的 处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。 影响原生质体融合的因素 首先，原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合 的首要条件。 其次，融合方法 其三是融合参数，包括各种融合液都应选择适当。 c.方法：物理方法（离心、振动、电激）、化学方法（聚乙二醇（PEG）） d.杂种细胞的筛选和培养：机械法、生理法、遗传法 e.杂种细胞的再生和鉴定：由愈伤组织再培养出杂种植株的过程 杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定 一、杂种细胞的发育动态 核质重组 细胞器重组 部分核物质或细胞器丢失 核分裂的非同步性 二、体细胞杂种的特点 形态上的趋中性 变异幅度大 非整倍性 双亲性状的共显性 偏亲现象 三、杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定 1．杂种细胞的选择系统 外观选择  互补选择  荧光标记选择 2．体细胞杂种的鉴定  形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。  细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。  生化鉴定：同功酶鉴定。  分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。 体细胞杂种的遗传特性 1．细胞分裂与染色体丢失 如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂 几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。 如果这样就会产生几种情况：A细胞＋B细胞质；A细胞＋B细胞质和部分染色体或基因。 2．基因转移与性状表达 由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生 整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有 时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。 3．体细胞杂种遗传上的不稳定性 体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远 近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。 ②优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，扩大杂交亲本范围，培育新优良品种。 ③举例：“白菜-甘蓝”同白菜相比，具有生长期短，耐热性强，和易储藏等优点。 应用 体细胞杂种的应用 一、体细胞杂种的应用潜力 1、 植物育种中的核质替换 2、 细胞质杂种的获得 3、 远缘杂交创造新物种 4、 细胞器的互作研究 体细胞杂交面临的困难1、 融合特性的高效性 2、 杂种细胞的培养和选择3、 杂种的遗传稳定性控制 体细胞杂交研究的发展趋势 1、 诱导融合及杂种细胞的各种生理、生化、遗传机理的研 究 2、 电融合的程序化控制研究 3、 各种类型原生质体（胞质体、核质体、细胞器）的制备技术研究 4、 杂种细胞培养技术的程序化研究

细胞工程论文

细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。下面是我为大家整理的细胞工程论文，欢迎阅读。

【摘要】 目的制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。

【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性

近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处,4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。

1 材料与方法

材料

实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3,脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。

方法

去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后,转入3%的TritonX100溶液,摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液，摇床37℃，50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。

支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。

人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。

人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定

取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L)，继续培养1 d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB显色。光镜下观察。

扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。

2 结 果

支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色,半透明,质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失,而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图1。

羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图

图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色

图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图2C，2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图2E)。

3 讨 论

理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的'迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似,仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。

由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质,IL1，IL8 等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。

总之 ，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。

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