jc1流式检测论文

博凌科为生物科技-为你解答：线粒体膜电位的降低是凋亡的一个早期事件，5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1)可用于流式细胞术检测线粒体膜电位的变化。正常细胞的线粒体膜电位电压较高，可形成JC-1的聚集体，发出红色荧光，而线粒体膜电位降低的细胞，则会形成JC-1单体，发出绿色荧光。材料： 细胞悬液 完全细胞培养基 去极化药物：如0.1mM valinomycin或0.25mM carbonyl cyanide m-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) in DMSO 1mg/ml JC-1储存液（溶于DMSO），分装成小包装，在－20℃可保存1年。 PBS 具有488nm激发光源的流式细胞仪，配备525－590nm带宽的滤镜。JC-1染色： 收集2105的细胞，用预温到37℃的新鲜完全培养基调整至1ml。制备阳性对照（以去极化药物处理过的细胞）。标本和阳性对照的染色步骤相同。 融化1管JC-1储存液，每1ml细胞悬液中通过边振荡边加的方式加入2.5L（终浓度：2.5ug/ml）。振荡细胞悬液直至标本形成均一的红紫色。 JC-1在水相容易形成聚集体，所以需要边振荡边加。未用完的JC-1不要再保存至－20℃。 37℃避光保存10分钟。 加入2ml PBS至细胞悬液中，500g室温离心5分钟，去上清。 以0.3ml PBS重悬细胞。上机取样，注意获取细胞的速度不要250至300细胞/秒。Fig1 HL-60 cells, (A) control and (B) depolarized (treated with 100 nM valinomycin), stained with 2.5 g/ml JC-1. Note the shift to the bottom and to the right by cells with depolarized mitochondria.Fig2 After incubation with 2.5 g/ml JC-1 at 37C, peripheral blood mononulear cells usually show a single population of monocytes, while here lymphocytes give rise to two separate peaks. This could indicate the presence of a functional heterogeneity within lymphocytes (A). Such a phenomenon, however, is not always present. Treating cells with valinomycin results in a loss of orange signal either from lymphocytes or from monocytes (B).

JC-1样品分析方案

概述

用测试化合物制备细胞

添加JC-1工作溶液（100μL/孔用于96孔板或25μL/孔用于384孔板）在室温或37℃孵育1小时

移除JC-1工作溶液

读取 Ex / Em = 490 / 525nm和490 / 590nm处的荧光强度

注意：以下是我们推荐的活细胞方案。 该方案仅提供指南，实际情况应根据您的具体需求进行修改。

1.准备JC-1工作解决方案：

1.1在高质量无水DMSO中制备2至10 mM JC-1的储备液。 应及时使用原液; 应将任何剩余的溶液等分并在<-20℃冷冻。

注意：避免反复冻融循环，避免光照。

1.2制备1X JC-1工作溶液：在实验当天，将JC-1固体溶解在DMSO中或将等分试样的JC-1储备溶液解冻至室温。 在Hanks和20 mM Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液（pH 7）和0.02％Pluronic®F-127中制备10至30μM1XJC-1工作溶液。 通过votexing很好地混合它们。

注意：JC-1不溶于水，因此它会在溶液中聚集。 建议在将JC-1工作溶液加载到池中之前对其进行过滤。

2.用荧光酶标仪进行JC-1检测：

2.1用测试化合物细胞培养所需的一段时间（例如，Jurkat细胞可以用喜树碱处理4-6小时）以诱导细胞凋亡。对于空白孔（没有细胞的培养基），加入相应量的化合物缓冲液。

2.2将100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板的JC-1工作溶液（来自步骤1.2）加入到细胞板中。

2.3将JC-1装载板在37℃，5％CO2培养箱中培养15-60分钟。

注意：适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。

2.4从平板上取下JC-1工作溶液，用HHBS或您选择的缓冲液清洗细胞。 将100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔HHBS板加回到细胞板中。

2.5监测Ex / Em = 490 / 525nm和490 / 590nm处的荧光变化以进行比率分析。

3.用荧光显微镜或流式细胞仪进行JC-1测定：

3.1用测试化合物细胞培养所需的一段时间（例如，Jurkat细胞可以用喜树碱处理4-6小时）以诱导细胞凋亡。

3.2离心细胞，每管取1-5×105个细胞。

3.3在500μLJC-1工作溶液中重悬细胞（来自步骤1.2）。

3.4在室温或37°C下孵育10至30分钟，避光。

3.5用您选择的HHBS或缓冲液洗涤细胞。 将细胞重悬于500μLHHBS中以获得每管1-5×10 5个细胞。

3.6用荧光显微镜（使用FITC和TRITC滤光片）或流式细胞仪（使用FL1和FL2通道）观察Ex / Em = 490 / 525nm和490 / 590nm处的荧光变化。