很高兴告诉你！蜡样芽孢杆菌是需氧性、有运动性、能产生芽孢的革兰氏阳性大杆菌。蜡样芽孢杆菌常在下列中存在，如乳、肉、蔬菜、甜点心、调味汁、凉拌菜、炒饭等。往往因不加热或加热不完全引起食物中毒。针对我对日出口高温杀菌中出现的腐败现象，经反复检测、试验，确定引起腐败变质的微生物为蜡样芽孢杆菌。本试验的目的为检测高温杀菌蜡样芽孢杆菌的污染现状与控制措施。 1 材料方法 11 设备和材料 吸管、培养箱、均质器、天平、菌落计数器、冰箱、微波炉、平皿、滤器、抽滤设备、无齿镊子。 12 培养基及试剂 NGKG寒天基础培地、NaCl、95％酒精、鸡蛋。 2 检测方法［1，2］ 21 水中蜡样芽孢杆菌的检测方法 211 原理 用孔径为045mm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上培养，计数滤膜上的典型蜡样芽孢杆菌菌落总数。 212 检验步骤 过滤水样：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将1000ml水样（如水样含菌数较多可减少过滤水样量或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门在-50kPa下抽滤。 培养：水样滤完后抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分移放在表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入恒温箱内，35℃培养48h。 结果观察：菌落特征为：35℃培养18h后，观察菌落，形成直径3～5mm，有的约10mm大而扁平、灰白色、粗糙的菌落。菌落表面粗糙似有毛玻璃状或溶蜡状，边缘呈扩展状。另外，在菌落周围因卵磷脂作用而形成明显的白至淡粉色的沉淀环。根据菌株不同，也有卵黄反应稍弱不形成沉淀环的。即典型菌落应符合蜡样芽孢杆菌特征：中心菌落呈白色不规则状，即一般不呈光滑的圆形，不呈典型凸起状，而是扁平凸起；白色菌落外是淡粉色环；必须有卵黄反应（在集落周围形成因卵黄作用形成的明显的浑浊圈，根据菌株不同，也有卵黄反应稍弱，形成浅浑浊环的东西）。 计数方法：在规定的培养时间内，取出平板观察，计数。 22 和环境中蜡样芽孢杆菌的检测方法 221 原理 蜡样芽孢杆菌呈卵磷脂酶阳性，在卵黄培养基上形成菌落周围明显的沉淀环。另，本菌在多粘菌素B中呈自然耐性，利用这些特性，使用作为选择分离培养基的加卵黄的NGKG寒天培地。 222 实验作 样品制备：以无菌作称取25g样品于灭菌均质杯内，加入225ml灭菌085％盐水，均质拍打30s，制成1∶10的样品匀液。预想到菌落会多的情况，进行梯度稀释。 分离接种：用无菌吸管分别吸取各梯度稀释液01ml分注到2个表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上。 培养：迅速以L行玻璃棒将接种物涂布于培地表面，避免涂到平板边缘，将平板正置，直至接种物被培养基吸收，将平板翻转，35℃培养48h。 菌落观察：同上。 计数方法：在规定的培养时间内，取出平板观察，计数直径3～5mm，有时10mm的大扁平、灰白色、粗糙的集落。若吸取各梯度稀释液01m1分注到2个表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上，则每g (ml)食品中蜡样芽孢杆菌的总数=2个平板上的菌落数的算术平均值×相应的稀释倍数×10。 例：将检样10-1稀释液各01ml涂布于2个NGKG寒天培地平板上，各生长蜡样芽孢菌20个，则1g样品中蜡样芽孢杆菌数为： [(20+20)／2]×10×101=20×103个／g 23 污染的检测 231 中蜡样芽孢杆菌的检测方法（如上） 232 水中蜡样芽孢杆菌的检测方法为滤膜法[1] 使用测余氯的方法为比色法[2]。目的是研究自来水中的游离余氯对蜡样芽孢杆菌的影响。 24 杀灭研究 蜡样芽孢杆菌耐热，其37℃16h的肉汤培养物的D80值为10~15min；使肉汤中细菌(24×107/ml )转为阴性需100℃20min。其游离芽胞能耐受100℃30min，而干热灭菌需120℃60min才能杀死。蜡样芽胞杆菌在4℃、pH43、盐浓度18％的条件下仍能存活或生长。通过高温杀菌或适当的冷藏可以控制蜡样芽胞杆菌的增殖。且蜡样芽孢杆菌喜农作物，一般以芽孢的形式存在于食品中，在我知道所以你知道！
蜡样芽胞杆菌与少数食物中毒有关(约2–5%)，包括一些严重的恶心、呕吐以及腹痛。大概来说，杆菌性食物中毒是由于错误地烹调方法造成细菌孢子残留在食物上，更糟糕的是食物被不当冷冻而让孢子发芽。细菌繁殖的结果是产生肠毒素，人食用含毒素的食物后会产生呕吐、腹泻等不良症状。许多食物都有可能造成这种腹泻，它有8–16个小时的潜伏期，之后便会引发腹泻和肠胃疼痛。而另一种潜伏期长的蜡样芽胞杆菌食物中毒，与产气荚膜梭菌所造成的病症极其相似。吃了冷藏不当而变质的剩饭是造成呕吐病症的最主要的原因。食用变质食物后1–5小时就会引起恶心、呕吐。这种病症与其他的变质引起的短期病症（如金黄色葡萄球菌所造成的）较难辨别。以前人们认为有毒物质产生效果的时间与以上两种类型有关，但事实上呕吐综合症是因一种只在引起呕吐的类型中发现的名为cereulide的毒素造成的，并且该产物不是蜡样芽胞杆菌的标准产物之一。Cereulide是一种由非核糖调控缩氨酸综合(NRPS)产生的即使在菌体内也是不常见的dodecadepsipeptide。两个科研小组独立发现这种转录是发生在pCERE01或是pBCE4810质体上。有趣的是，该种质体与有毒的pXO1质体主要构成相同，pXO1是炭疽杆菌中编码毒素的基因，但却处在不同的致病岛上。蜡样芽胞杆菌的牙周分离同样具有不常见的类pXO1质体。
là yàng yá bāo gǎn jūn
Bacillus cereus
属:Bacillus 种:
属:芽孢杆菌属 种:蜡样芽孢杆菌
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌产生肠毒素。
蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。
在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。
蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高。
蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（610月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。
当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中毒。
蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。呕吐型的潜伏期为小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期为615小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。
蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为×35μm，兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力。
蜡样芽胞杆菌生长温度为2537℃，最佳温度3032℃。在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上生成的菌落较大，直径310mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状。偶有产生黄绿 *** 素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血。在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）平板上，呈伊红粉色菌落。
蜡杆芽胞杆菌耐热，其37℃16小时的肉汤培养物的D80℃值（在80℃时使细菌数减少90%所需的时间）约为1015分钟；使肉汤中细菌（×107/mL）转为阴性需100℃20分钟。其游离芽胞能耐受100℃30分钟，而干热灭菌需120℃60分钟才能杀死。
产生蜡状杆菌溶血素（鼠致死毒素，溶血素I）和溶血素BL。
SN 017692 出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法
枯草芽孢杆菌，是芽胞杆菌属的一种。菌体在生长过程中会产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。就枯草芽孢杆菌的生理特性来说，它能分泌一种酶叫植酸酶，而植酸酶能降解土壤中大部分的植酸盐，为植物生长提供需要的营养，同时枯草芽孢杆菌还能产生生长素，促进植物的生长。所以在考虑将其发酵制成菌剂用于农林业时，枯草芽孢杆菌还具有以下作用：1、提高作物抗病、抗寒、抗旱能力；2、改良土壤团粒结构、提高化肥利用率、减少农药化肥的使用；3、促使土壤中的有机质分解成腐殖质，刺激作物生长。4、促进作物生长、成熟、降低成本、增加产量、提高收入；5、解磷、解钾、固氮、有效的增加土壤中植物可吸收的养分。地衣芽孢杆菌是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热，它可能以孢子形式存在，从而抵抗恶劣的环境；在良好环境下，则可以生长态存在。该可调整菌群失调达到目的，可促使机体产生活性物质、杀灭致病菌。能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。
问题一：微生物学通报初审有不需要修搞的吗 各位： 写了篇文章，想投稿微生物学通报，想问一下这个期刊是不是核心期刊？一般的版面费是多少？审稿需要多长时间？一般什么时候能得到录用通知？这个期刊的水平怎么样？急求！谢谢 举报删除此信息 ellieyin (站内联系TA) 我学姐投过 说一个月审稿 euteamo (站内联系TA) 是中科院微生物所的杂志，很规范，要求也较严格，建议回复提问时注明引用，是货真价实的核心期刊，不过没微生物学报级别高，如果感觉不错的话，改投后者更佳，我五年前投了一稿，审稿2个月左右， gl19860312 (站内联系TA) 微生物学通报，是核心期刊 一般的版面费是200 或者250 期刊主页上面有 审稿国内一般要30天左右 收到录用通知 从投稿到接受一般2 3个月 这个期刊的水平 很不错 核心期刊 awvc (站内联系TA) 五、发表费和稿费 论文一经录用，将在发表前根据版面收取一定的发表 费(200 元/面，彩图另加500 元，不计数量)，并酌付稿酬 (50 元/面)。期刊出版后给每篇文章的作者寄送2 本样刊。 编辑部会及时开据发票、并以挂号信邮寄给作者。 编辑部会留有发票的复印件、并保留3 个月，逾期编辑 部将不再负责提供任何收据。 六、联系方式 地址: (100101)北京市朝阳区北辰西路1 号中科院微 生物所内 awvc (站内联系TA) 投稿方式 我刊现已启用远程投稿系统，投稿时请登陆我刊新网址，首次远程投稿需要先注册，然后按照您的用户名和密码登录，点击稿件管理―投稿，按照提示提交您的稿件，作者必须在网站投.doc格式的电子稿，添加行号，图与文字编好页码、图号后合成一个文件上传。凡不符合要求〈书写要求〉的文稿，本刊恕不受理。 本刊所有通知会同时发给投稿作者和通讯作者（能对稿件负责的人，导师或课题负责人），所以注册和投稿时请务必正确填写其E-mail邮箱；必要时编辑会通过电话联系作者，所以投稿作者或第一作者最好填写手机号以确保及时联系。 我们收到贵稿后一般会在当日或次日（节假日除外）给您发去“收稿回执”；通过编辑部内审后您将收到“审理费通知单”，请您根据要求补寄150元审理费。 作者网上注册流程： 首先登录我刊网址，点击页面左上方作者稿件查询下的〔注册〕，在出现的页面中逐一填写个人信息，标有*输入项为必填项，输入完成后点击页面下方的〔注册〕，系统会提示：“注册成功! 点此登录本系统！” 注册和投稿时若出现问题，请及时联系编辑部(Tel: ; E-mail: [email protected] )，我们会在第一时......>> 问题二：微生物学报和微生物学通报哪个好? 在国内来说都挺牛的，都是中科院主办的。个人认为微生物学报更好一些 问题三：微生物就业前景怎么样？就业方向如何 基础微生物主要包括基础微生物和应用微生物。 学基础微生物的，基本就是去研究所和大学，但是这个要坚持念完博士，不然还是要和应用微生物的竞争。 学应用的就业包括，发酵工程相关的行业（啤酒、酸奶等），防疫检测部门，生物制药等等，不一而足，还是很广阔的。 问题四：微生物学的就业前景怎么样 微生物专业的毕业生，可对口的工作类型有：酿造、发酵、制药、质检、作物改良、食品生产、生物技术公司、科研单位等，应该说就业前景还是很不错的。 问题五：微生物的发展前景 微生物学前景 一、微生物学在解决人类面临的五大危机中的作用 人所共知，当前人类正面临着多种危机，诸如粮食危机、能源匮乏、资源紧缺、生态恶化和人 *** 炸等。人类进入21世纪后，将遇到从利用有限的矿物资源时代过渡到利用无限的生物资源时代而产生的一系列新问题。由于微生物细胞不仅是一个比面值（specificsurface）大、生化转化能力强、能进行快速自我复制的生命系统，而且它们还具有物种、遗传、代谢和生态类型的多样性，使得它们能够在解决人类面临的各种危机中发挥其不可替代的独特作用。现分述如下。 （一）微生物与粮食 粮食生产是全人类生存中至关重要的大事。微生物在提高土壤肥力、改进作物特性（如构建固氮植物）、促进粮食增产、防治粮食作物的病虫害、防止粮食霉腐变质以及把多余粮食转化为糖、单细胞蛋白、各种饮料和调味品等方面，都可大显身手。 （二）微生物与能源 当前，化石能源日益枯竭问题正在严重地困扰着世界各国。微生物在能源生产上有其独特的优点：①把自然界蕴藏量极其丰富的纤维素转化成乙醇。据估计，我国年产植物秸秆多达5～6亿吨，如将其中的10％进行水解和发酵，就可生产燃料酒精700～800万吨，余下的糟粕仍可作饲料和肥料，以保证土壤中钾、磷元素的正常供应。目前已发现有高温厌氧菌例如Closiridiumthermocellum（热纤梭菌）等能直接分解纤维素产生乙醇。②利用产甲烷菌把自然界蕴藏量最丰富的可再生资源――“生物量”（biomass）转化成甲烷。这是一项利国、利民、利生态、利子孙的具有重大战略意义的措施。③利用光合细菌、蓝细菌或厌氧梭菌类等微生物生产“清洁能源”――氢气。④通过微生物发酵产气或其代谢产物来提高石油采收率。⑤研究微生物电池并使之实用化。 （三）微生物与资源 微生物能将地球上永无枯竭之虞的纤维素等可再生资源转化成各种化工、轻工和制药等工业原料。这些产品除了传统的乙醇、丙酮、丁醇、乙酸、甘油、异丙醇、甲乙酮、柠檬酸、乳酸、苹果酸、反丁烯二酸和甲叉丁二酸等外，还可生产水杨酸、乌头酸、丙烯酸、己二酸、丙烯酰胺、癸二酸、长链脂肪酸、长链二元醇、2，3-丁二醇、γ-亚麻酸油和聚羟基丁酸酯（PHB），等等。由于发酵工程具有代谢产物种类多、原料来源广、能源消耗低、经济效益高和环境污染少等优点，故必将逐步取代目前需高温、高压、能耗大和“三废”严重的化学工业。 微生物在金属矿藏资源的开发和利用上也有独特的作用。第九章中已述及的细菌沥滤技术，就可把长期以来废弃的低品位矿石、尾矿、矿渣中所含的铜、镍、铀等十余种金属不断溶解和提取出来，变成新的重要资源。 （四）微生物与环境保护 在环境保护方面可利用微生物的地方甚多：①利用微生物肥料、微生物杀虫剂或农用抗生素来取代会造成环境恶化的各种化学肥料或化学农药；②利用微生物生产的PHB制造易降解的医用塑料制品以减少环境污染；③利用微生物来净化生活污水和有毒工业污水；④利用微生物技术来监察环境的污染度，例如用艾姆氏法检测环境中的“三致”物质，利用EMB培养基来检查饮水中的肠道病原菌等。 （五）微生物与人类健康 微生物与人类健康有着密切的关系。首先是因为各种传染病构成了人类的主要疾病，而防治这类疾病的主要手段又是各种微生物产生的药物，尤其是抗生素。自从遗传工程开创以来，进一步扩大了微生物代谢产物的范围和品种，使昔日只由动物才能产生的胰岛素、干扰素和白细胞介素等高效药物纷纷转向由“工程菌”来生产。与人类生殖、避孕等密切相关的甾体激素类药物也早已从化工生产方式转向微生物生物转化......>> 问题六：微生物菌种怎么选择啊？ 市面上有很多微生物制剂的菌种，多种多样，造成在选择上产生很大困惑，下边是选择菌种的方法： 1、微生物菌种选择 动物消化道微生物具有多样性和特异性，不同动物种类对菌种的要求不同，同一菌株用于不同动物，产生的效果差异也较大。使用时一定要掌握菌种的特性和功效，选择不当起不到应有效果，反而会破坏原有菌群，甚至引发疾病 2、微生物菌种应用时间 微生物制剂应用要从子畜开始使用，以保证有益菌优先定植。因为制剂进入体内后要有一段时间进行微生物菌群调整才能定植下来。 一般认为，乳酸菌类在各种动物的各阶段添加均较好，芽孢杆菌类在生长期添加较好，在幼龄期可以添加;曲霉菌类在幼龄期，水产动物全期不必添加;酵母菌类在生长期不必添加;在水产动物养殖中，以改善水质为目的时，可将微生物制剂或光合细菌直接洒于水中。 3、微生物菌种添加方式 一般粉状饲料添加微生物制剂效果较好，颗粒饲料和膨化饲料在加工过程中的高温可造成10%~30%的芽孢杆菌，90%以上的肠球菌以及99%以上的酵母失活，而乳酸杆菌几乎全部被杀灭。因此，在颗粒饲料中要使用耐热，耐挤压的芽孢杆菌制剂。乳酸菌不耐高温，应采用冻干后包被或采用喷雾干燥的方式制成的乳酸菌制剂。使用时最好采用饮水方式，以利于乳酸菌优先粘附于肠壁。 4、微生物菌种剂量与浓度 微生物制剂中必须含有相当数量的活菌才能达到效果。当进入动物肠道食糜中外源菌数大于1000万个每克时，都会对肠道内原有菌群产生较大的影响。因此，微生物制剂在产品中活菌数含量为10亿~20亿每克时效果最佳。 我国正式批准生产的微生物制剂中规定每克芽孢杆菌含量要多于5亿个。以酵母菌产品为例，目前市场上销售的产品活菌数从每克几亿到200亿不等，在选择是要认真鉴别。 5、微生物菌种抗生素的影响 细菌类的微生物制剂对抗生素敏感，不宜与抗生素同时使用，使用微生物制剂的前后二天应停止使用抗生素。最好先用抗菌药物清理肠道，为益生菌的定植和繁殖扫除障碍，然后再饲喂微生物制剂，可提高使用效果。酵母菌类属于真核生物，生物学活性与细菌完全不同，对抗生素、磺胺类药物和一些抗菌剂有天然抗性，可与抗生素同时使用。 6、微生物菌种保存条件和期限 微生物制剂均为活菌制剂，由于大多数菌种在饲料加工、运输中容易失活，应用中要注意保存期限。通常微生物制剂应密封保存于阴凉避光处，储存时间不宜过长，有效期一般为一年左右，随着保存时间的延长，活菌数量不断减少。厌氧菌类暴露在空气中容易死亡，有的产品对其进行了包被或真空包装处理，应在打开包装后规定的时间内用完。酵母类属于兼性厌氧菌，可以保存较长时间。芽孢杆菌类有效期比其他类型长，可达2年左右。 问题七：学哥，学姐们请问江南大学微生物学怎么样，难考吗 楼主，您好，江南大学的微生物学专业在比南大的知名度高，所以相对来说肯定考江南大学的，以后毕业就业相对也好一点。
见《我国西北干旱地区森林土壤中苏云金芽孢杆菌生态分布》我国西北干旱地区森林土壤中苏云金芽孢杆菌生态分布王学聘，戴莲韵， 杨光滢， 张万儒摘要： 对地处我国西北干旱地区新疆、甘肃、宁夏三省(区)内的11个自然保护区——哈纳斯、小叶白蜡、天山云杉、野核桃、塔里木、东大山、贺兰山、六盘山、崆洞山、兴隆山、莲花山等自然保护区采集的260个森林土壤样品，进行了生态因子调查；分析了土壤pH、含水量、水解N、有效P、速效K、全N、有机质；研究了芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌数量和种类生态分布。共分离苏云金芽孢杆菌42株，其出土率和分离率分别为和。关键词： 自然保护区； 森林土壤； 芽孢杆菌； 苏云金芽孢杆菌； 生态分布； 西北干旱地区中图分类号： 文献标识码： A文章编号：1001-1498(1999)05-0467-07The Ecological Distribution of Bacillus thuringiensisof the Northwest Arid Region in ChinaWANG Xue-pin1， DAI Lian-yun2， YANG Guang-ying1， ZHANG Wan-ru1( Research Institute of Forestry,CAF,Beijing 100091，China； Research Institute of Forest Ecology，Environment and Protection，CAF，Beijing 100091，China)Abstract： The 260 forest soil samples were collected from 11 natural reserves of the northwest arid region in China. The soil pH，moisture content，hydrotytic N，efficient P，availabe K， total N， and organic matter of the soils were determined. The ecological factor of 11 natural reserves were also investigated. The number and distribution of both Bacillus and Bacillus thuringiensis were 42 strains of were isolated from the soil ratio of the number of the soil samples containing to number of total soil samples tested is ％. The ratio of the number of isolated to the number of sporoforming Bacillus examed is ％. Key words： natural reserve； forest soil； Bacillus；Bacillus thuringiensis； ecological distribution; northwest arid region 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Berliner（简称.）)是目前害虫生物防治、植物抗虫育种中研究较为深入，应用较为广泛，经济效益、生态效益和社会效益较明显的一类微生物。不仅其杀虫剂已广泛应用于农、林、卫生害虫的生物防治，而且，利用.杀虫毒蛋白基因构建的转化载体对植物进行转化，已培育出抗虫棉花（Gossypium sp.）烟草（Nicotiana tabacum L.）、蔬菜以及杨树（Populus sp.）等抗虫品种〔1〕。因此研究苏云金芽孢杆菌生态学和地理分布对发现新资源，筛选高效、广谱、新型.杀虫剂菌株，以及发现新杀虫毒素蛋白基因均有着十分重要的理论意义和实践价值。早在60年代初，人们已注意和提出了.生态学和地理分布问题，Delucca、Ohta、李荣森、戴莲韵等〔2～5〕相继对美国、日本、中国部分农田土壤和未开垦的森林土壤以及中国东部季风区不同森林立地带森林土壤中.资源及生态分布进行了研究，不仅发现了许多新资源，同时证明了苏云金芽孢杆菌是土壤中分布较广泛的一类细菌。作者在完成我国东部季风区8个森林立地带13个自然保护区森林土壤中苏云金芽孢杆菌生态分布研究的基础上〔5〕，1997～1998年对我国西北干旱地区3个森林立地带的11个自然保护区森林土壤中苏云金芽孢杆菌生态分布又进行了研究，现报道如下。1 材料和方法 自然概况 根据张万儒等〔6〕中国森林立地分类系统，土壤样品采集选自地处我国西北干旱地区新疆、甘肃、宁夏3个省(区)11个自然保护区林下土壤。11个自然保护区的主要自然概况和地理分布见表1。 土壤样品采集方法 采用随机踏采的方法，采自西北干旱地区11个自然保护区林下土壤0～5 cm土层，其样品数见表1。表1 11个自然保护区的主要自然概况采 集 地 点 气温＞10 ℃的时间/d 土 壤 类 型 主 要 植 被 及 林 型 采 集 土 样 海拔高/m 土样数/个 新疆布尔津县哈纳斯新疆落叶松（Larix sibiricaLedeb.）自然保护区 105～180 山地灰色森林土 草类-灌木-新疆落叶松林 1380 10 山地灰色森林土 草类-新疆落叶松林 1600～2000 10 山地灰色森林土 苔草-新疆落叶松林 1600～2100 10 山地灰色森林土 藓草-草类-新疆冷杉、新疆落叶松林 2200 10 新疆伊犁喀什河小叶白蜡(Fraxinus bungeanaDC.)自然保护区 105～180 沙质轻盐土 小叶白腊林 740 20 新疆巩留县库尔德宁天山云杉（Picea tianshanicaRupr.）自然保护区 105～180 山地灰褐色森林土 中生草类-天山云杉林 1330 5 山地灰褐色森林土 河谷-溪旁-阔叶林-天山云杉林 1470 10 山地灰褐色森林土 中旱生灌木-草类(鸢尾)-天山云杉林 1520 5 山地灰褐色森林土 欧洲鳞毛蕨-天山云杉林 1620 5 山地灰褐色森林土 锦鸡儿(灌木)-草类-天山云杉疏林 1980 5 土地灰褐色森林土 草类-匍匐圆柏-天山云杉林 2400 10 新疆巩留县野核桃(Juglans regia L.)自然保护区 105～180 灰褐色森林土 野核桃林 1270 20 新疆塔里木(尉犁、轮台)胡杨(Populus euphratica Oliv.)自然保护区 181～225 胡杨林土 荒漠胡杨林 800 20 甘肃张掖县祁连山青海云杉（Picea .）自然保护区 181～225 山地灰褐色森林土 藓类-青海云杉林 2950 10 山地灰褐色森林土 草类-灌木-青海云杉林 3050 10 宁夏石咀山市贺兰山自然保护区 181～225 褐土 油松、山杨混交林 2000 7 褐土 山杨纯林 2200 7 山地灰褐色森林土 青海云杉林 2500 6 宁夏固原、隆德县六盘山自然保护区 181～225 褐土 油松、辽东栎、杨桦次生林 2000 20 甘肃平凉市崆洞山自然保护区 181～225 褐土 油松、辽东栎林 2000 20 甘肃榆中县兴隆山自然保护区 181～225 褐土 辽东栎、杨桦落叶阔叶林 2200 20 甘肃临潭、康乐县莲花山自然保护区 181～225 褐土 阔叶林、灌木林 2500 20 注：苔草(Carex spp.)，新疆冷杉(Abies sibirica Ledeb.)，鸢尾(Iris tectorum Maxim)，欧洲鳞毛蕨(Dryopteris fibrilosa Clarke )，锦鸡儿(Caragana sp.)，匍匐圆柏(Sabina sp.)，野核桃(Juglans cathayensis Dode.)，青海云杉(Picea crassifolia Kom.)，油松(Pinus tabulaeformis Carr.)，山杨(Populus davidiana Dode)，辽东栎(Quercus liaotungensis Koidz.)，桦(Betula spp.)，杨（Populus spp.）。 芽孢杆菌及苏云金芽孢杆菌的数量分析 芽孢杆菌及苏云金芽孢杆菌的数量分离方法见参考文献〔7〕。苏云金芽孢杆菌的出土率和分离率均以同一自然保护区、同一类型土壤为单位，按戴莲韵〔5〕报道的计算公式计算。 土壤pH、含水量及养分测定 见参考文献〔6，7〕。 苏云金芽孢杆菌亚种鉴定及杀虫活性测定 主要采用形态特征和11项生理生化特性鉴定。其方法见参考文献〔8〕。对鳞翅目(Lepidoptera)的杨扇舟蛾(Clostera anachoreta Fabricius)，鞘翅目(Coleoptera)的榆兰叶甲(Pyrrhalta aenscens Firmaire)幼虫的室内生物测定方法见参考文献〔6，7〕。2 结果与分析 11个自然保护区森林土壤中芽孢杆菌数量分布与其生态因子的关系 表2表明：芽孢杆菌在西北干旱地区11个自然保护区森林土壤中分布广泛，其数量变化范围为每克干土×106～×106个，其中新疆塔里木和巩留库尔德宁天山云杉自然保护区数量最少，分别为每克干土×106个和×106个，而甘肃祁连山和崆峒山自然保护区数量最多，分别为每克干土×106个和×106个。11个自然保护区土壤pH均为中性偏碱，对芽孢杆菌数量的影响无明显规律性；土壤含水量及化学物质的分析结果表明：甘肃崆峒山及新疆塔里木(胡杨)自然保护区芽孢杆菌总数高或低与土壤水解N、全N及有机质含量的高低有一定关系。其余自然保护区各因子之间无明显的规律性。表2 11个自然保护区森林土壤中芽孢杆菌数量与其生态因子的关系自然保护区 土壤类型 土 壤 化 学 物 质 每克干土中芽孢杆菌数量/个×106 pH 含水量/(－1) 水解N/(－1) 有效P/(－1) 速效K/(－1) 全N/(－1) 有机质/(－1) 新疆哈纳斯自然保护区 山地灰色森林土 ～ 新疆小叶白蜡自然保护区 沙质轻盐土 ～ 新疆巩留县库尔德宁天山云杉自然保护区 山地灰褐色森林土 ～ 新疆巩留县野核桃自然保护区 灰褐色森林土 ～ 新疆塔里木自然保护区 胡杨林土 ～ 甘肃张掖县祁连山自然保护区 山地灰褐色森林土 ～ 宁夏石咀山市贺兰山自然保护区 褐土，山地灰褐色森林土 ～ 宁夏固原、隆德县六盘山自然保护区 褐土 ～ 甘肃平凉市崆峒山自然保护区 褐土 ～ 甘肃榆中县兴隆山自然保护区 褐土 ～ 甘肃临潭、康乐县莲花山自然保护区 褐土 ～ 苏云金芽孢杆菌的出土率和分离率 表3表明：(1)新疆塔里木(胡杨)及宁夏六盘山自然保护区，未分离到苏云金芽孢杆菌。(2)甘肃莲花山和新疆哈纳斯自然保护区苏云金芽孢杆菌分离率较高，分别为和。(3)西北干旱地区11个自然保护区苏云金芽孢杆菌平均出土率和分离率分别为和。这一结果均较我国东部季风区13个自然保护区和偏低〔6〕。表3 11个自然保护区芽孢杆菌及苏云金芽孢杆菌数量分布自 然 保 护 区 采集土样数/个 每克干土芽孢杆菌菌落数/个×106 观察芽孢杆菌菌落数/个 苏云金芽孢杆菌. 出现.的土样数/个 分离出的.数/个 比例① 出土率/% 比例② 分离率/% 新疆哈纳斯自然保护区 40 229 7 8 7／40 8／229 新疆小叶白蜡自然保护区 20 250 4 6 4／20 6／250 新疆巩留县库尔德宁天山云杉自然保护区 40 111 3 3 3／40 3／111 新疆巩留县野核桃自然保护区 20 246 3 7 3／20 7／246 新疆塔里木自然保护区 20 61 0 0 0／20 0 0／61 0 甘肃张掖县祁连山自然保护区 20 232 1 1 1／20 5 1／232 宁夏石咀山市贺兰山自然保护区 20 81 1 1 1／20 5 1／81 宁夏固原、隆德县六盘山自然保护区 20 120 0 0 0／20 0 0／120 0 甘肃平凉市崆峒山自然保护区 20 167 2 2 2／20 10 2／167 甘肃榆中县兴隆山自然保护区 20 209 4 4 4／20 20 4／209 甘肃临潭、康乐县莲花山自然保护区 20 218 5 10 5／20 25 10／218 平均值(或合计) 260 1 924 30 42 30／260 42／1 924 ①出现.土样数/分离土壤样品数，②分离.数/观察芽孢杆菌数 苏云金芽孢杆菌种类鉴定及杀虫活性测定 苏云金芽孢杆菌在我国西北干旱地区11个自然保护区森林土壤中亚种形成特征见图版Ⅰ，11项生理生化特性鉴定的初步结果及对杨扇舟蛾幼虫和榆兰叶甲幼虫的杀虫活性测定结果分别列入表4和表5。根据苏云金芽孢杆菌形态特征和11项生理生化特性对42株.菌株鉴定结果表明，属于苏云金亚种(. Berliner，1915)的1株占分离总数的；库尔斯塔亚种(. Barjac ＆ Lemi lle，1970)的共5株占；加拿大亚种(. Barjac ＆ Bonnefoi，1972)的共9株占；九州亚种(. Ohba and Aizawa，1979）的共4株占；山东亚种(. 王瑛等，1986)的共9株占。待定菌株共14株占。其分布情况，除新疆塔里木(胡杨林)和宁夏六盘山未分离到.菌株外其余自然保护区均有分布，其中新疆哈纳斯和甘肃莲花山自然保护区分布最广泛。对两种害虫杀虫活性测定结果表明：对杨扇舟蛾幼虫高效菌种为6株，占分离株的，对榆兰叶甲幼虫无明显杀虫活性。图版Ⅰ 苏云金芽孢杆菌伴孢晶体和芽孢扫描电镜形态特征图(2 200～3 500 ×)：表4 苏云金芽孢杆菌亚种在11个自然保护区森林土壤中的分布苏云金芽孢杆菌亚种名称(.) 自 然 保 护 区 总数/株 占总数比例/% 哈纳斯 小叶白蜡 天山云杉 野核桃 塔里木 东大山 贺兰山 六盘山 崆峒山 兴隆山 莲花山 thuringiensis 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 kurstaki 2 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 5 canadensis 2 0 0 5 0 0 0 0 0 0 2 9 kyushucnsis 0 3 0 0 0 0 0 0 0 1 0 4 shandongiensis 2 0 0 1 0 0 0 0 1 1 4 9 (待 定) 2 2 1 2 0 0 0 0 1 2 4 14 表5 11个自然保护区森林土壤中苏云金芽孢杆菌种类及杀虫活性自然保护 区 菌号 生 理 生 化 特 性 生 物 测 定 反应 卵磷脂酶 水杨苷 解朊作用 色素形成 蔗糖利用 脲酶产生 水解七叶灵 甘露糖利用 水解淀粉 纤维二糖 亚种名称. subspecies 杨扇舟蛾幼虫3 d死亡率/% 榆兰叶甲幼虫死亡率/% 哈纳斯 ha1 ＋ － ＋ ＋ － ＋ － ＋ － ＋ ＋ 待 定 0 20 ha2 + + + + - - + + - + + kurstaki 90 0 ha3 + + + + - - - + - + + shandongiensis 0 0 ha4 + + + + - + - + - + + cunadensis 0 10 ha5 + + + + - + - + - + + cunadensis 0 10 ha6 + + + + - - + + - + + kurstaki 100 0 ha7 + + + + - - - + - + + shandongiensis 0 0 ha8 - + + + - - - + - + + 待 定 0 0 小叶白蜡 Xiao9 - + + + - - - + + + + 待 定 0 10 Xiao10 + + + + - + - + + + + thuringiensis 0 0 Xiao11 + + + + - - - + + + + kyushuensis 0 0 Xiao12 - + + + - - - + - + + 待 定 50 0 Xiao13 + + + + - - - + + + + kyushuensis 0 0 Xiao14 + + + + - - - + + + + kyushuensis 10 20 天山云杉 Tian15 - + + + - + - + - + + 待 定 0 40 Tian16 + + + + - + - + - + + kurstaki 100 0 Tian17 - + + + - + - + - + + 待 定 0 0 野核桃 Ye20 + + + + - - - + - + + shandongiensis 0 10 Ye21 + + + + - + - + - + + canadensis 0 0 Ye22 + + + + - + - + - + + canadensis 20 10 Ye23 + + + + - + - + - + + canadensis 0 0 Ye24 + + + + - + - + - + + canadensis 0 0 东大山 Dong25 + + + + - - + + - + + kurstaki 90 0 贺兰山 He26 + + + + - - + + - + + kurstaki 100 0 崆峒山 Kong27 - + + + - - - + - + + 待 定 0 10 Kong28 + + + + - - - + - + + shandongiensis 0 0 兴隆山 Xing29 - + + + - - - + - + + 待 定 0 10 Xing30 + + + + - - - + - + + shandongiensis 0 0 Xing31 + + + + - - - + + + + kyushuensis 0 10 Xing32 - + + + - - - + + + + 待 定 0 0 莲花山 Lian33 + + + + - - - + - + + shandongiensis 20 0 Lian34 + + + + - - - + - + + shandongiensis 60 0 Lian35 + - + + - - - + - + + 待 定 0 0 Lian36 - + + + - - - + - + + shandongiensis 0 0 Lian37 + + + + - - - + - + + shandongiensis 0 25 Lian38 + + + + - + - + - + + canadensis 0 0 Lian39 + + + + - + - + - + + canadensis 0 0 Lian40 - + + + - - - + - + + 待 定 0 0 Lian41 + - + + - - - + - + + 待 定 0 0 Lian42 + - + + - - - + - + + 待 定 0 0 塔里木 0 六盘山 0 3 结 论 (1)通过对我国西北干旱地区11个自然保护区森林土壤中芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌生态分布的研究，进一步证明这类细菌在森林土壤中分布广泛，其数量分布规律与其所处生态环境的水、热、养分组成等综合生态因子密切相关。 (2)苏云金芽孢杆菌在我国西北干旱地区的出土率和分离率分别为和，均低于美国科罗拉多州未开垦的森林土壤和我国东部季风区13个自然保护区森林土壤的平均出土率和分离率(和)，而与日本18个县136个森林土样的分离率相接近。 (3)苏云金芽孢杆菌在西北干旱地区出现的优势亚种为加拿大亚种及山东亚种，经鉴定尚有14株菌为未知亚种，是否新亚种有待进一步研究。 (4)西北干旱地区分离的42株苏云金芽孢杆菌对鳞翅目的杨扇舟蛾幼虫杀虫死亡率在50%以上有8株，其中5株杀虫死亡率在90%以上，为苏云金芽孢杆菌杀虫剂提供了高效菌株。基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670603)。作者简介：王学聘(1937-)，男，北京市人，研究员。作者单位：王学聘 杨光滢 张万儒 中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091； 戴莲韵 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，北京 100091参考文献：〔1〕 王学聘，韩一凡，戴莲韵，等.抗虫转基因欧美杨的培育〔J〕.林业科学，1997，33(1)：70～74.〔2〕 Deluoca A J G，Larson A thuringiensis distribution in soils of the United States 〔J〕. ，1981，27（9）：865～870.〔3〕 Ohta M，Aizawa of Bacillus thuringiensis in soils of Japan 〔J〕. . Path.，1986，47（3）：277～282.〔4〕 李荣森，戴顺英，李子刚，等.我国部分地区土壤中的苏云金芽孢杆菌和球型芽孢杆菌〔J〕.微生物学报，1990，30(5)：380～388.〔5〕 戴莲韵，王学聘，杨光滢，等.我国森林土壤中苏云金芽孢杆菌生态分布的研究〔J〕.微生物学报，1994，34(6)：449～456.〔6〕 张万儒，盛炜彤，蒋有绪，等.中国森林立地分类研究〔J〕.林业科学研究，1992，5(3)：251～265.〔7〕 戴莲韵，王学聘，杨光滢，等.我国四个自然保护区森林土壤中苏云金芽孢杆菌的分布〔J〕.林业科学研究，1993,6(6)：621～626.〔8〕 戴莲韵，王学聘.苏云金芽孢杆菌的一个新亚种〔J〕.微生物学报，1988，28(4)：301～306.收稿日期：1999-02-10
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这个要看你们学校要求的查重系统是哪款，如果是笔杆，那他就是准确的。如果要求的是知网，那知网才是最准确的。不同系统之间算法，数据库的不同，查重结果也是有差异的。因此，不能放一起比较。
应该可靠，但是可能不准，和要求有差距。还是要找对于的查重系统才准确。
每个软件的数据库不太一样。笔杆论文查重，我用过，也是在学校用的，还不错，跟知网相差不大。如果学校用的是知网，最后再用跟学校一样的知网。
修改:相关网站:我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定 1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 亚碲酸钾 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（）84份中有23份（）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份()仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4．免疫荧光技术5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。7. 全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性 。免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；2) 用毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；4) 用毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素()等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。PCR技术扩增体系的基本成分引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度 。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度 mmol/L。 PCR技术循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。循环参数1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。循环参数2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃变性时间（秒） 30 30 60 6055℃复性时间（秒） 30 30 60 6072℃延伸时间（秒） 30 38 120 180一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。PCR扩增产物的检测方法PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。23SrRNA基因特征：原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。应用：检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．小结自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
0引言脆性X综合征（fragile X syndrome, FXS）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragile X mental retardation, FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.1材料和方法材料大肠杆菌DH5α, BL21（ DE3）和表达载体pRSET A均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司； 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司. 方法 表达载体的构建根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR扩增体系25 μL，灭菌去离子水10 μL，10×反应缓冲液 μL，25 mmol/L MgCl2 μL，DMSO μL，4× dNTP混合物（每种 mmol/L）2 μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol，模板 μL（50 ng/μL）， Taq DNA（5 μ/μL）聚合酶 μL. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在T4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中， 37℃振荡培养12 h， 按10 mL/L比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，32℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达.蛋白表达形式的分析取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH ）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析.融合蛋白的纯化将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱结束后，用4 mL漂洗液（20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH ），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH ) 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集. 取收集液，进行SDSPAGE分析.与（CGG）29重复序列双链DNA结合实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL（100 ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组分别加入25 μL（100 ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP1（500 μg/mL）15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl， mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，沸水煮10 min，进行SDSPAGE分析.2结果原核表达载体的构建及鉴定扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，分别为 ku和504 bp（图2），均与预计结果相同.的表达用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒，筛选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的 BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导后，在Mr 约25 000处出现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分. 经SDSPAGE分析表明，CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）. 蛋白纯化在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游， 插入有连续6个组氨酸的序列 —(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. SDSPAGE显示，CGGBP1得到较高程度的纯化（图4）.与5′d（CGG）293′重复序列双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入CGGBP1后，未和5′d (CGG）293′重复序列双链DNA结合的蛋白也被洗脱（图5）.3讨论关于微卫星的产生机制，普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列，通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程. 脆性X综合征是Igarashi等［7］研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义. 本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.
大肠埃希菌201株耐药性分析胆盐抑制冷冻保存大肠杆菌生长的研究分子生物学中常用的大肠杆菌菌株大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
结核病是我国的常见传染病之一、近年发病率又有回升,仍是危害我国人民健康的一个重要疾病。由于结核杆菌生长缓慢、培养困难的特点和目前检测结核杆菌的方法存在种种不足,寻找一种快速、准确、敏感、方便和实用的结核杆菌检测方法仍是一项重妥课题。 我们合成了一对长20bp的引物,使用华美生物工程公司的叹,aq酶,在69’C的条件下退火并延伸,以二步法扩增一段长123bp的结核杆菌特异的重复DNA序列,用于检铡洁核杆菌。这段123bp的DNA片段中有一个sall酶切位点,有助于鉴定PCR产物的特异性.我们的实验结果证明该PCR方法能从人型结核杆菌,牛型结核杆菌中扩增出特异的123bpDNA片段,并为Sall酶切成二段.从堪萨斯分枝杆菌,胞内分枝杆菌等非结核病致病菌中不能扩增出123匕pDNA片段,显示该方法对结核病致病菌有较好的特异性,该方法能用于检测各种临床标木中极微量的结核菌
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结核杆菌与麻风杆菌是分枝杆菌属中的主要病原菌。 结核杆菌菌体细长略带弯曲，有分枝生长趋势。菌体含脂量高，与其抗酸特性、抵抗力特性、致病性与免疫性等都有密切关系。该菌营养要求高，生长缓慢，形成“菜花状”菌落。 一、结核杆菌检验程序 结核病人病灶中查到结核杆菌，是病原学诊断的重要依据，根据感染部位不同，可采集病人的痰、尿、粪便、脑脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序进行检验。 二、结核杆菌培养特性 1. 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。 2. 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。 3. 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。 三、齐~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法【原理】 结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核杆菌及其他分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。【材料】 1. 结核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。 2. 抗酸染色液 3. 载物玻片、玻片夹、酒精灯、腊笔等。【方法】 1. 无菌手续采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。 2. 用腊笔将涂面局部隔开，滴加石炭酸复红染液，酒精灯上加热至出现蒸气。切勿沸腾，亦不可使染液干涸。如有干涸的趋势，应及时补加染液。持续染色5-8分钟，待冷后流水漂去多余的染液。 3. 用3%盐酸酒精清脱色，脱至涂面无色为止，约1-3分钟，自来水冲洗。 4. 滴加吕氏美兰染液复杂30秒~1分钟，水洗。自然干燥或吸干后油镜检查。【结果】 1. 结核杆菌呈现细长，略有弯曲的红色菌体，有的可表现出分枝特征，有的菌体表现有多数浓染颗粒。结核杆菌大多分散排列，亦可以见到有纵行条索状排列。 2. 涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每毫升痰液内含菌量至少应有500个以上，甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染色标本片观察中，不一定每个视野都能看到结核杆菌。 3. 结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、球状颗粒，亦称Much颗粒。 4. 标本已经高压灭菌处理，不影响染色结果，也保证操作者的安全。 四、荧光染色法 此系用金胺荧光素染扩酸性细菌的方法，简便易行，但不具特异性。金胺染色法有多种、现列于后表，可选择使用，应用荧光显微镜检查结果。 五、结核杆菌毒力试验——动物试验法 【材料】 1. 动物：体重200~250克豚鼠2只 2. 结核杆菌培养物或结核病人检验材料（痰、尿、粪、腹水等材料经浓缩集菌） 3. 注射器及消毒用材料等。【方法】 1. 选取结核菌素试验为阴性的豚鼠两只。 2. 吸取结核杆菌悬液或病人检材，注入豚鼠腹股沟皮下 3. 注射后每周定期检查一次，观察豚鼠腹股沟淋巴结是否肿大，局部变硬，化脓及体重减轻、体温升高等症状。 4. 给豚鼠作结核菌素试验，是否出现阳性结果。 5. 6周后，将豚鼠进行解剖，观察淋巴结是否肿大，有无干酪性病变，肝、脾、肺等是否肿大，表面有无灰白色结节病灶，取可疑病灶进行涂片染色镜检和分离培养。若为阳性结果，可报告“动物接种后××天查到有结核菌感染”。如无症状及病变者，可报告为阴性。 六、结核杆菌浓缩集菌法（以处理痰标本为例）【材料】 结核病人24小时痰液，细口瓶，酚红液、汽油，NaOH，无菌生理盐水等。【方法】(一)漂浮法： 1. 取24小时痰液15毫升，装入细口瓶内，加入2倍量摇匀，高压灭菌或煮沸20—30分钟杀菌。 2. 待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振荡20—30分钟，用生理盐水加至液面与瓶口齐，静置半小时。 3. 取瓶口表面油状物涂于载物玻片上，微微加热，干后再加，如此重复5—6次，至厚度适宜，烘干待冷，抗酸染色，油镜头检查。 (二)沉淀法： 1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高压无菌或煮沸20—30分钟后，加入酚红指示剂毫升，剧烈振荡混匀，亦可置37℃水浴消化30分钟。 2. 矫正PH为，3000转/分离心30分钟，弃去上清液。 3. 取沉淀物涂片染色镜检。若进行分离培养和动物接种，可免去高压灭菌或煮沸的程序。 附录：抗酸染液的配制 1. 石炭酸复红液：称取碱性复红4克，溶于95%酒精100毫升中成饱和液。再取饱和液10毫升与5%石炭酸溶液90毫升混匀即成。 2. 3%盐酸酒精：取浓盐酸3毫升，95%酒 97毫升混合。 3. 吕弗勒氏碱性美兰液：称取美兰2克，溶于95%酒精100毫升中，配成饱和液，取饱和液30毫升，再加入蒸馏水100毫升及10%氢氧化钾水溶液毫升即成。
一般是抽全血提取外周血单个核细胞（PBMC）提取DNA，（结核分枝杆菌是胞内寄生菌，可存在于白细胞中），然后设计合适的PCR引物直接进行扩增即可。